转基因大米TT51-1品系精准定量检测方法的比较研究

基于大米蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因和TT51-1品系特异性基因序列筛选适用于数字PCR的内、外源基因特异性引物探针并建立转基因大米TT51-1品系的双重数字PCR定量方法。其定量的绝对灵敏度和相对灵敏度分别达2 copies/μL和0.1%。当样品中TT51-1转基因大米成分含量低至0.1%时,6次定量值的相对标准偏差在7.30%~18.63%之间,偏差在-8.77%~9.62%之间,精密度和稳定性均较为理想,而同样的引物探针所建立的实时荧光PCR方法定量的相对灵敏度仅达到1%。为促进该方法的标准化应用,将微滴式数字PCR平台上建立的定量方法在芯片式数字PCR平台上进行室内验证,结果表明该方法的定量精密度和准确性符合要求。该方法可应用于大米、稻谷及其初加工产品中TT51-1转基因大米成分的精准定量检测。

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT51-1中外源基因多重PCR检测方法

针对转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)TT51-1及其回交后代中外源基因的检测建立了一种三引物多重PCR检测方法。结果表明,三引物PCR体系可以准确区分cry1Ab/cry1Ac基因纯合、杂合和阴性三种基因型,纯合体中只扩增出一条298 bp片段,阴性材料中只扩增出一条787 bp片段,杂合体中同时扩增出298 bp片段和787 bp片段。该体系的建立为利用TT51-1进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技术。

基于TT51-1水稻种子标准曲线检测的可靠性分析

为了分析在同一个实验室的2台不同型号的实时荧光定量PCR仪(扩增曲线和标准曲线的相关参数)可比性,在常规条件下,使用同一批号的试剂,将标准品及同一水稻种子样品TT51-1在2台荧光定量PCR仪上进行扩增,对标准曲线的参数及分析结果进行比对,分析其一致性。结果表明,作为单一的检测系统,运用同一批号试剂对相同标准品及待检样品的试验中,2台实时荧光定量PCR仪测定的结果差异没有统计学意义(P>0.05)。通过对标准曲线的相关参数和待检测样品的检测结果的分析,可以判定实验室存在的2台实时荧光定量PCR仪检测的结果的一致性,可确保检测结果可靠。

转基因水稻TT51—1标准物质的研制

将筛选后的转基因水稻qT51—1和非转基因水稻明恢63种子分别冷冻研磨成粉末，采用重量法配置了5个不同水平的标准物质。经检验该标准物质的均匀性良好，可在4℃保存条件下存储1年。标准物质采用重量法的质量分数作为标准值，数字PCR测定拷贝数分数作为参考值，通过转基因水稻与非转基因水稻种子粉末提取效率比值校准的数字PCR定值结果与重量法质量分数定值结果之间具有等效一致性，该标准物质可用于转基因水稻TT51—1的定量PCR检测及其特异性检测方法的评价。

Cry1Ab/Ac抗虫基因克隆与原核表达

针对转基因水稻TT51-1插入的Bt基因,扩增全长序列并克隆至pGEM-T载体.测序验证后利用HindⅢ与BamHⅠ双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体.转化重组构建的pET-28a-cry至BL21(DE3)宿主菌,在0.1mmol/L IPTG诱导下获得以包涵体形式表达的目的蛋白.经SDS-PAGE凝胶回收法获得相对分子质量约7.1×104的目的蛋白rCRY,为转基因作物检测新方法的开发提供了物质基础.