TTF-1相关蛋白26磷酸化位点对人SP-B基因表达的影响

目的探讨甲状腺转录因子-1相关蛋白26(TAP26)对人肺表面活性蛋白-B(hSP-B)基因表达的调控机制。方法采用定点诱变PCR技术,分别突变掉TAP26的4个磷酸化位点(S48,S66,T219和T167S168),并获得TAP26的4个相应突变体;通过体外细胞共转染和荧光素酶报告基因活性值检测技术分别检测上述4个突变体对hSP-B基因启动子活性的影响。结果与野生型TAP26比较,突变体质粒TAP26(T167S168→V167A168)、TAP26(S48→A48)和TAP26(T219→V219)分别与hSP-B基因启动子共转染后所测荧光素酶活性值无明显差异(P>0.05);而当DNA浓度为400 ng的突变体质粒TAP26(S66→A66)与hSP-B基因启动子共转染后所测荧光素酶活性值则明显降低(P<0.05)。结论突变体质粒TAP26(S66→A66)不能促进hSP-B的表达,从而TAP26的S66蛋白激酶C(PKC)位点是TAP26移位到细胞核的重要部位。

miR-26、TGF-β1、REGγ在子宫内膜癌组织中的表达及相关性研究

目的 探讨微小RNA-26(miR-26)、转化生长因子β1(TGF-β1)、蛋白酶体激活因子11S调节蛋白复合物γ亚单位(REGγ)在子宫内膜癌组织中的表达及相关性。方法 收集60例子宫内膜癌组织(内膜癌组)、20例子宫内膜增生组织(内膜增生组)、20例正常增殖期子宫内膜组织(正常组),实时荧光定量PCR(qPCR)法检测子宫内膜组织中miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平。比较三组子宫内膜组织中miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平差异;收集子宫内膜癌患者临床病理特征,分析其临床病理参数与miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平关系;Pearson法分析子宫内膜癌组织miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平之间及其与临床分期、分化程度的相关性;绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平对子宫内膜癌的诊断价值。结果 正常组、内膜增生组、内膜癌组,miR-26表达水平依次降低,TGF-β1、REGγ表达水平依次升高,组间比较差异有统计学意义(P<0.001)。子宫内膜癌组织中的miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平与其临床分期、组织分化和淋巴结转移有关(P<0.05),与肌层浸润程度无关(P>0.05)。子宫内膜癌组织miR-26表达水平与TGF-β1、REGγ表达水平均呈负相关关系(P<0.001),而TGF-β1、REGγ表达水平之间呈正相关关系(P<0.001);miR-26表达水平与临床分期呈负相关关系,与分化程度呈正相关关系(P<0.001);TGF-β1、REGγ表达水平与临床分期呈正相关关系,与分化程度呈负相关关系(P<0.001)。子宫内膜癌患者miR-26、TGF-β1、REGγ表达水平诊断子宫内膜癌的AUC分别是0.705/0.745/0.760,低于联合诊断方法的0.861。结论 miR-26、TGF-β1、REGγ在子宫内膜癌组织中表达异常,与临床分期、组织分化程度相关,且三者之间互相相关,联合用于诊断子宫内膜癌的临床价值显著。

结直肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26的表达及对肿瘤侵袭、转移的影响

目的探究结直肠癌组织中层粘连蛋白β1(LAMβ1)、肌动蛋白相关蛋白2/3复合体4(ARPC4)及间隙连接蛋白26(Cx26)的表达及与肿瘤侵袭、转移的关系。方法选取2018年6月至2019年12月如皋市人民医院病理科收集的100例结直肠癌手术切除的肿瘤组织及相应的癌旁正常组织,应用实时荧光定量PCR检测肿瘤组织及癌旁正常组织LAMβ1、ARPC4、Cx26的mRNA表达;Western blot检测肿瘤组织及癌旁正常组织LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达,免疫组织化学法检测LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达阳性率,并分析LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达与患者临床病理特征的关系。结果RT-PCR结果显示,结直肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx2的mRNA表达相较于癌旁组织上调。Western blot检测结果显示,结直肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达高于癌旁组织(P<0.05)。免疫组化结果显示,LAMβ1、ARPC4、Cx26着色主要分布于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中。不同性别、年龄、肿瘤大小结直肠癌患者LAMβ1、ARPC4、Cx26表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同分化程度、临床分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移结直肠癌患者LAMβ1、ARPC4、Cx2表达比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,结直肠癌肿瘤组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26的mRNA表达量存在正相关性(P<0.05),其蛋白表达之间同样存在正相关性(P<0.05)。结论LAMβ1、ARPC4、Cx26表达升高与结直肠癌的侵袭、转移有关。

甲状腺转录因子-1及相关蛋白26对SP-B基因表达的调控作用

甲状腺转录因子-1(thyroidtranscriptionfactor-1,TTF-1)是调节SP-B基因表达的关键因子。最近研究发现了一种新的蛋白即TTF-1相关蛋白(TAP26),它不仅能与SP-B基因启动子近侧序列相互作用,而且还能与TTF-1形成蛋白复合物,促进SP-B基因的表达。采用染色质免疫沉淀分析证实TAP26是肺细胞中SP-B启动子转录复合物的一个组成部分,为SP-B基因表达的调控提供分子机制。

6-姜烯酚通过调控微小RNA-26a-5p/DAPK1减轻脑缺血/再灌注损伤的机制研究

目的探讨6-姜烯酚(6-SH)是否通过促进微小RNA-26a-5p(miR-26a-5p)表达并抑制死亡相关蛋白激酶1(DAPK1),减轻氧糖剥夺/复氧(OGD/R)神经细胞自噬及神经细胞钙超载,并探究其潜在机制。方法取体外培养的对数生长期小鼠海马神经元HT22细胞,用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞活性,寻找Na2S2O4的最佳制模浓度。将HT22细胞分为空白对照组(NC组)、OGD/R组(无糖培养基+10 mmol/L Na2S2O4处理1.5 h后换正常培养基培养4 h)、6-SH干预组(OGD后用10μmol/L 6-SH培养4 h)、阴性对照抑制剂预处理组(阴性对照抑制剂转染48 h后行OGD,再用6-SH培养4 h)、miR-26a-5p抑制剂预处理组(miR-26a-5p抑制剂转染48 h后行OGD,再用6-SH培养4 h)。采用CCK-8法检测各组细胞活性;透射电镜下观察细胞超微结构;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测DAPK1、miR-26a-5p基因表达;分子对接验证6-SH与miR-26a-5p的相互作用;双荧光素酶验证DAPK1与miR-26a-5p的靶向关系;流式细胞仪测定细胞内Ca2+水平;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测磷酸化谷氨酸受体2B(p-NMDAR2B)Ser1303、DAPK1、自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p-DAPK1 Ser308蛋白表达;免疫荧光法检测LC3和Beclin1的表达。结果CCK-8法检测结果显示,6-SH干预组细胞活性较OGD/R组明显升高,miR-26a-5p抑制剂预处理组细胞活性较6-SH干预组明显降低。透射电镜下显示,6-SH干预组自噬小体较OGD/R组明显减少,miR-26a-5p抑制剂预处理组自噬小体较6-SH干预组明显增多。RT-qPCR检测结果显示,与OGD/R组比较,6-SH干预组miR-26a-5p表达明显上调,DAPK1 mRNA表达明显下调;与6-SH干预组比较,miR-26a-5p抑制剂预处理组miR-26a-5p表达明显下调,DAPK1 mRNA表达明显上调。分子对接验证6-SH与miR-26a-5p可互相作用。双荧光素酶报告基因检测显示,与阴性对照组比较,mmu-miR-26a-5p显著下调m-DAPK1-3UTR-WT的荧光素酶表达,说明两者之间存在结合作用。流式细胞仪检测结果显示,与OGD/R组比较,6-SH干预组细胞内Ca2+水平明显降低;与6-SH干预组比较,miR-26a-5p抑制剂预处理组Ca2+水平明显升高。Western blotting检测结果显示,与OGD/R组比较,6-SH干预组p-NMDAR2B Ser1303、DAPK1、Beclin1、LC3蛋白表达均明显降低(p-NMDAR2B Ser1303/β-actin:2.34±0.27比4.78±0.39,DAPK1/β-actin:1.40±0.13比2.37±0.21,Beclin1/β-actin:2.61±0.32比4.32±0.29,LC3/β-actin:2.52±0.45比5.09±0.18,均P<0.05),p-DAPK1 Ser308蛋白表达明显升高(p-DAPK1 Ser308/β-actin:0.66±0.09比0.40±0.02,P<0.05);与6-SH干预组比较,miR-26a-5p抑制剂预处理组p-NMDAR2B Ser1303、DAPK1、Beclin1、LC3蛋白表达明显升高(p-NMDAR2B Ser1303/β-actin:4.08±0.14比2.34±0.27,DAPK1/β-actin:1.96±0.15比1.40±0.13,Beclin1/β-actin:3.92±0.31比2.61±0.32,LC3/β-actin:4.33±0.33比2.52±0.45,均P<0.05),p-DAPK1 Ser308蛋白表达明显降低(p-DAPK1 Ser308/β-actin:0.33±0.12比0.66±0.09,P<0.05);免疫荧光法检测显示,与OGD/R组比较,6-SH干预组LC3、Beclin1荧光强度明显降低;与6-SH干预组比较,miR-26a-5p抑制剂预处理组LC3、Beclin1荧光强度明显升高。结论6-SH可通过调控miR-26a-5p/DAPK1减轻细胞自噬及钙超载,从而减轻神经细胞损伤。