抱茎独行菜种皮粘液质相关基因TTG1的克隆、表达分析及功能鉴定

抱茎独行菜(Lepidium perfoliatum L.)为十字花科具典型粘液质繁殖体植物,而TTG1基因(Transpa-rent testa glabra 1)所编码的蛋白是调控种皮细胞分化并影响粘液质释放的转录因子。目前关于TTG1基因在粘液质繁殖体植物中的研究报道较少,为探究TTG1基因在抱茎独行菜粘液质发育中的作用,本研究利用同源克隆技术获得抱茎独行菜TTG1基因cDNA开放阅读框(ORF)序列,命名为LpTTG1。序列分析表明,该基因ORF全长为1032 bp,编码343个氨基酸,含有WD40基序;qRT-PCR分析结果显示,该基因在抱茎独行菜各组织中均有表达,反映了该基因功能的多样性;免疫组织化学定位结果表明,LpTTG1在种子发育过程中内珠被和外珠被的表达水平变化与外珠被粘液质的合成过程相一致,推测该基因可能参与调控抱茎独行菜种皮的发育及粘液质的形成。将LpTTG1基因转化拟南芥,该基因的过量表达显著促进了粘液质合成途径下游基因AtMUM4在角果中的表达,表明该基因有可能参与粘液质合成途径调控,并促进下游产物MUM4的产生。然而,对LpTTG1转基因拟南芥与野生型植株表型的比较发现,两者种子形态及粘液质分泌与释放方式均无显著差异,这可能是因为抱茎独行菜种皮发育和粘液质形成是一个多基因调控的复杂过程,某一基因的过量表达也许不会引起明显的表型变化。

粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因转化拟南芥的表型研究

[目的]将过量表达典型粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因(LpTTG1)的转基因拟南芥株系表型与野生型和突变体进行比较,为深入研究LpTTG1基因的功能提供参考依据。[方法]在体视显微镜下,通过对拟南芥野生型、ttg1突变体及LpTTG1基因过表达转基因株系的植株表型,幼苗叶表皮毛、下胚轴和根毛以及种子形态进行观察比较。[结果]拟南芥ttg1突变体与野生型和LpTTG1过表达转基因型的幼苗在下胚轴的颜色、根毛着生方式、真叶表皮毛等方面有显著差异,但后两者表型间无显著差异。[结论]缺失TTG1基因可导致拟南芥幼苗形态发生显著变化,但此基因过量表达不一定对拟南芥形态产生影响。

芥菜型油菜毛状根诱导体系构建及TTG1基因功能初步研究

黄籽油菜具有种皮薄、出油率高等优点,研究油菜黄籽的形成具有重要的意义。前期研究表明,TTG1(TRANSPARENT TESTA GLABRA 1)基因参与了油菜种皮颜色的形成。本研究利用发根农杆菌A4菌株诱导了芥菜型油菜四川黄籽的毛状根,并研究了菌液浓度和外植体部位对诱导率的影响。结果表明,菌液浓度OD值为0.8时,诱导效率最高,平均为71.5%;外植体中下胚轴的发根率最高,平均为87.3%。在四川黄籽毛状根中过表达TTG1基因,发现原花色素合成途径中的DFR(dihydroflavonol4-reductase)、ANS(anthocyanidinsynthase)和BAN(anthocyanidin reductase)基因的表达受到抑制。本研究优化了油菜毛状根的诱导体系,为利用毛状根体系进行基因功能验证提供了新的思路和方法。

植物表皮毛发育控制基因GL2遗传互作因子的筛选和鉴定

表皮毛广泛存在于陆生植物的地上部分,是植物与环境之间的一道天然屏障,具有多种重要的生物学功能。拟南芥HD-Zip家族转录因子GLABRA 2(GL2)是调控表皮毛形成和发育的关键因子,通过筛选和鉴定GL2的遗传互作因子,可以为进一步研究植物表皮毛发育调控的分子机制奠定基础。通过大规模的遗传筛选和图位克隆,获得了一个叶片上完全没有表皮毛的突变体M12-01,遗传分析表明M12-01 single突变表型受隐性单核基因控制。M12-01 single突变体表型与拟南芥TRANSPARENT TESTA GLABKA 1(TTG1)基因的功能缺失突变体表型相似。对TTG1基因的测序结果显示其+445位碱基由鸟嘌呤突变为腺嘌呤,从而使编码的甘氨酸变为精氨酸。本研究证实TTG1突变能增强gl2-3突变体的表型,GL2基因与TTG1基因之间存在遗传互作,这为进一步研究GL2调控植物表皮毛发育的分子机制提供了新的遗传材料。

转化生长因子β1活化肝星状细胞反式激活新基因剪切体的功能

目的探讨反式激活新基因剪切体TTG1A的生物学功能和参与肝纤维化的致病机制。方法应用酵母双杂交系统3，将PCR扩增的TTG1A基因与酵母表达载体pGBKT7连接，转化酵母细胞AH109，并在其内表达，而后与转化了人白细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合，在涂有X—α—gal营养缺陷型培养基上进行双重筛选，提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经BglⅡ酶切后测序，进行生物信息学分析。结果成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTG1A。应用酵母双杂交系统3从人白细胞文库中筛选出19个与TTG1A相互作用的蛋白，其中包括人类主要组织相容性复合物Ⅱ型DPD（HLA—DPB）、人类核糖体蛋白L30、人类核磷蛋白B23、人类核组蛋白2、人类ash2、人类变异的家族性脾性贫血和变异的异染性脑白质营养不良相关蛋白、人类死亡因子4（MORF4L1）、人类遍在蛋白偶连酶E2L3、人类载脂蛋白A-1（APOA1）、人类半乳凝素1以及5个未知功能蛋白。结论成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTG1A，初步揭示了新基因TTG1A的生物学功能，为进一步研究TGFβ1介导的肝纤维化分子发病机制中的作用提供基础。

茄子花青素合成中SmTTG1、SmGL3和SmTT8的表达及其蛋白质间的相互作用

采用同源克隆方法从茄子(Solanum melongena L.)中分离得到3个基因,分别命名为Sm TTG1、Sm GL3和Sm TT8。序列分析表明,Sm TTG1的c DNA全长1 220 bp,开放阅读框为1 029 bp,编码342个氨基酸,与马铃薯(S.tuberosum L.)TTG1基因序列同源性达到94%,成熟蛋白等电点为4.90,具有典型的WD结构域;Sm GL3的c DNA全长2 329 bp,开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,与马铃薯GL3基因序列相似性达到94%,蛋白等电点为5.61,有典型的HLH结构域;Sm TT8的c DNA全长2 242 bp,开放阅读框为1 896 bp,编码631个氨基酸,与马铃薯TT8基因序列同源性为85%,蛋白等电点为5.18,有典型的HLH结构域。荧光定量检测结果表明,Sm TTG1、Sm GL3和Sm TT8在茄子根、茎、叶、花、果皮和果肉中均有表达,但表达水平具有组织特异性。酵母双杂交结果表明,Sm TTG1与Sm TT8、Sm GL3之间有相互作用,并且Sm TTG1、Sm GL3和Sm TT8都与Sm MYB之间发生作用。推测Sm TTG1为WD40转录因子,Sm GL3和Sm TT8为b HLH转录因子,它们都参与调控茄子花青素的合成。

‘津田’芜菁Transparent Testa Glabra 1(BrTTG1)基因的克隆及表达分析

TTG1(Transparent Testa Glabra 1)蛋白是一种WD40类蛋白,参与植物的生长和发育。采用RT-PCR方法从芜菁品种‘津田'中克隆了BrTTG1 cDNA序列(GenBank登录号HM208590)。该基因cDNA开放阅读框长度为1 014 bp,编码一个由337个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白分子量为37.28 kDa,理论等电点为4.66。与其他植物中的TTG1蛋白进行同源性比对结果显示,BrTTG1与甘蓝型油菜的TTG1同源性最高。BrTTG1蛋白在31～337位氨基酸处含有WD40超家族的保守结构域。荧光定量PCR检测BrTTG1在‘津田'芜菁不同组织中的表达结果表明,该基因在有花青素合成的红色‘津田'芜菁根皮中表达量最高。

甘蓝型油菜BnTTG1-1基因的功能分析

拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtTTG1作为WD40重复转录因子存在于细胞核中,对表皮毛形成、花青素合成和储藏物质积累等具有重要调节作用。该研究从甘蓝型油菜(Brassica napus)品种秦优7号中克隆获得了BnTTG1-1基因的全长CDS序列,对其进行了烟草(Nicotiana benthamiana)叶片细胞的亚细胞定位研究,检测了BnTTG1-1在油菜(B.campestris)中的时空表达模式,并比较分析了BnTTG1-1对多个生物学过程的影响作用。结果表明,BnTTG1-1定位于烟草叶片细胞的细胞核中,推测其作为转录因子发挥调节作用。BnTTG1-1广泛存在于油菜营养组织和发育的种子中。在突变体ttg1-13背景下,异源表达BnTTG1-1基因能够完全恢复该突变体的多个表型,如无表皮毛形成和花青素合成、种皮呈黄色、种子脂肪酸和储藏蛋白含量高以及在种子萌发和幼苗形态建成过程中对高葡萄糖和高盐胁迫耐受力差等。由此可知,甘蓝型油菜BnTTG1-1与拟南芥AtTTG1在植物生长发育的多个生物学过程中具有类似的功能。

滇水金凤TTG1同源基因的克隆及表达分析

TTG1 (TRANSPARENT TESTA GLABRA1)基因编码具有WD40重复序列的蛋白,是调控植物花青素合成的重要因子。本研究以滇水金凤(Impatiens uliginosa)花器官为材料,采用RT-PCR技术克隆得到滇水金凤TTG1同源基因,其cDNA全长为1 038 bp,编码345 aa,命名为IuTTG1。系统发育分析发现,IuTTG1与百脉根聚为一支,同源性达81.84%。通过荧光定量分析发现,IuTTG1在4种不同花色以及4个不同花发育时期的滇水金凤中均有表达,其中以深红色滇水金凤的盛花期表达量最高,白色滇水金凤的始花期表达量最低。本研究结果为进一步探究滇水金凤花色形成及变异机理、花色改良及新品种培育提供科学依据。