同时检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪细环病病毒1型和2型的多重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

在集约化养殖条件下,猪场常见多种病毒混合感染。本试验研究的5种病毒与多种猪病相关,在全球范围的猪场造成了严重的经济损失。本研究建立了能同时检测和鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细环病病毒1型和2型(TTSuV1和TTSuV2)的多重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法能够区分这5种病毒,且对其他DNA病毒检测证明了该系统的特异性。该多重实时荧光定量PCR灵敏度高,检测限为3.65×103～5.04×103拷贝DNA模板/反应。批内和批间变异系数低。该方法对临床样本的检测结果与特异性PCR方法检测结果符合率为100%。这种方法可能成为流行病学研究和疾病控制的有效工具。

2017-2018年吉林部分地区规模化猪场猪细环病毒的遗传变异分析

为了解猪细环病毒(TTSuVs)在吉林部分规模化猪场的遗传变异情况,对2017-2018年来自吉林部分地区的10家规模化猪场的574份血清样品进行TTSuVs流行情况调查,并根据收集地点对20株TTSuVs进行ORF1全基因序列扩增及遗传变异性分析。结果显示:10家规模化猪场中,TTSuV1感染率为36.75%,TTSuV2感染率为63.2%,TTSuV1与TTSuV2混合感染率为30.3%。10株TTSuV1测序株之间的核苷酸同源性为75.7%~94.7%,氨基酸同源性为48.1%~88.2%;10株TTSuV2测序株之间的核苷酸同源性为77.5%~94.0%,氨基酸同源性为70.6%~87.4%。研究表明:吉林地区部分规模化猪场流行的TTSuV1均属于TTSuV1-lb型,而TTSuV2流行情况较为复杂,各种亚型均有涉及且呈现遗传变异多样性。

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。

猪细环病毒1型环介导等温扩增方法的建立

猪细环病毒(Torque teno sus virus,TTSu V)是一种无囊膜,单链的DNA病毒,存在猪细环病毒1型和猪细环病毒2型2个亚型。为建立一种新型快速的TTSu V1检测方法。针对TTSu V1保守的非编码区域(untranslated regions,UTR)设计2对LAMP引物,并对反应体系和反应条件进行了优化调整,建立了TTSu V1 LAMP检测方法。结果表明该方法最佳反应条件为62℃1 h,病毒最低检出限可达9.2 copies/μL,特异性良好。LAMP反应是一种集特异性强,灵敏度高,反应速度快于一体的的基因检测方法,有望成为快速检测TTSu V1的手段之一。

广东猪输血传播病毒流行病学调查及其主要抗原编码区进化分析

为了解广东省猪群中猪输血传播病毒(TTSuVs)的感染情况,采用Nest-PCR方法对广东省7个不同地区规模化猪场抽检采集的159份育肥猪血清进行检测。结果表明,TTSuVs的2个种——TTSuV1和TTSuV2的阳性检出率分别为54.72%和35.22%,二者的共感染率为29.56%,说明TTSuVs在广东猪群中有较为广泛的传播。挑选Nest-PCR检测TTSuV1和TTSuV2为阳性的样品,分别在病毒保守区设计引物,扩增病毒基因,测序验证后,与其它已发表的不同属种TTVs ORF1序列进行进化树分析。结果表明猪TTVs与人、犬、猫、猴的TTVs分别处在进化树的不同分枝,具有很大差异;本次研究获得的TTSuV1ORF1序列与国内多株已发表的TTSuV1ORF1序列相似性为72%～75%;获得的TTSuV2ORF1序列与现有测序的多株TTSuV2的ORF1序列相似性为88%～97%。此研究为进一步研究TTSuVs流行状况、血清学诊断方法和临床防治技术奠定基础。