TTV1与TTV2 SYBR-Green I实时荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立输血性传播病毒(TTV)基因1型(TTV1)和TTV基因2型(TTV2)的检测方法,本研究根据TTV1与TTV2基因的非编码区域序列差异,设计了2对特异引物,建立了鉴别TTV1和TTV2的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。分别进行了特异性、敏感性及重复性检验,结果表明:重组质粒建立的标准曲线相关系数为99%;可以同时鉴别检测TTV1和TTV2,检测PCV2和PRRSV阳性样品均呈阴性,表明该方法具有良好的特异性;最低检出量为10 copies/μL;重复试验结果显示,TTV1组内和组间变异系数分别为0.14%和0.74%;TTV2组内和组间变异系数均为0.13%;检测现地采集的189份样品,TTV1阳性率32.3%,TTV2阳性率6.3%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率28.6%。TTV检测方法的建立为猪群TTV病的流行病学调查提供了有效的手段。

我国猪群中TTV的鉴定及其分子流行病学分析

为了确定Torque teno virus(TTV)在我国猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法首次检测了来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品。结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为37.6%和82.6%。两者的混合感染率为38.4%。挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分非编码区(UTR)片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2病毒UTR序列进行比较分析,同时我们选择了8份阳性样品进行了TTV1和TTV2的全长基因的扩增和克隆。分析结果显示TTV可分为TTV1和TTV2两大分支,其中我们分离获得的TTV1和TTV2之间的UTR核苷酸同源性分别为80.8%～98.5%和94.2%～100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%～100%和95.5%～99.1%。本研究首次证实在我国猪群中存在TTV感染,提示我们对猪群感染的TTV是一个不容忽视的新病原。

中国猪群存在Torque teno Virus(TTV)感染

为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型，基于TTV1和TTV2相对保守的5’非翻译区（5’UTR）设计引物，采用PCR法对2008～2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明，中国猪群，TTV1的感染率为15．9％，TTV2的为34．8％，共感染率为5．8％。所扩增片断的核苷酸序列分析结果表明，中国TTV1和TTV2流行毒株之间的核苷酸同源性分别为87．3％～93．8％和74．8％～99．1％，与GenBank其他TTV1和TTV2毒株的同源性分别为69．6％～100．0％和74．8％～99．1％。系统进化分析结果表明，中国TTV1和TTV2流行毒株存在新的基因亚型。

山东省猪群TTV感染情况及分子流行病学分析

为了确定Torque teno virus(TTV)在山东省猪群中是否存在及其感染情况,本研究利用套式PCR方法检测了来自山东省不同地区10个猪场的230份血液样品和组织样品。结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为45.2%和85.7%。两者的混合感染率为39.3%。用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分片段,并将扩增出的部分基因与已报道的TTV1和TTV2病毒序列进行比较分析。分析结果显示TTV可分为TTV1和TTV2两大分支,其TTV1和TTV2与参考株相比同源性分别为88.0%～92.8%和91.9%～94.1%。本研究证实在山东省猪群中存在TTV感染,由于TTV可以感染人,其在公共卫生学方面的意义应当引起我们的重视。

猪源TTV Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据TTV1和TTV2的非编码区(UTR)的保守序列分别设计并合成两套特异性引物和Taqman探针,建立了鉴别TTV1和TTV2的Taqman实时荧光定量PCR方法。通过常规PCR方法分别克隆TTV1和TTV2的非编码区(UTR)的保守序列并将其连入pMD18-T载体,制备阳性标准品,优化反应条件,以10倍系列稀释的标准品分别绘制标准曲线,TTV1标准曲线的相关系数为0.984,TTV2标准曲线的相关系数为0.994。检测结果显示,两种方法的灵敏度均可达10 copies/μL,除猪源TTV外,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪2型圆环病毒、猪流感病毒检测结果均为阴性。该方法重复性好,批内和批间变异系数均小于3%。检测采集自广西和内蒙古的44份病料,TTV1的阳性率为47.73%,TTV2阳性率为70.45%,TTV1和TTV2混合感染的阳性率为31.82%。猪源TTV检测方法的建立为该病毒的流行病学调查和定量提供了有效的手段。

中国西南地区猪群中TTV分子流行病学调查

为了解西南地区猪群中Torque teno virus(TTV)感染流行情况,以TTV 5′非编码区(5′UTR)保守序列设计引物,建立了猪TTV检测的巢式PCR(nPCR)方法,并对该地区22个规模化养猪场363份血清进行了检测。结果表明,在被检血清样品中TTV1和TTV2感染率为79.6%、87.1%,两者的混合感染率为68.3%。证实TTV在西南地区猪群中广泛存在,提示人们应当重视防止TTV感染的进一步流行。