小鼠初级精母细胞GC-2中TUBB4B的表达及其对NF-κB和MAPK信号通路的调控

目的探究微管蛋白(TUBB4B)与胞浆羧肽酶(CCP1)在小鼠初级精母细胞(GC-2)中的互相作用关系,以及TUBB4B在调控GC-2发育中的作用。方法使用慢病毒感染GC-2细胞分别构建TUBB4B基因敲减组(TUBB4B-KD组)和阴性对照组(NCKD组);TUBB4B基因过表达组(TUBB4B-OE组)与阴性对照组(NC-OE组),利用嘌呤霉素筛选稳定细胞株。采用RT-qPCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测细胞模型是否构建成功,并进一步探究在GC-2细胞中TUBB4B与CCP1二者之间相互调控的表达关系。CCK8及流式细胞术检测TUBB4B沉默和过表达后对GC-2细胞增殖及周期的影响;Western blot及细胞免疫荧光实验找出TUBB4B沉默和过表达后发生表达改变的信号通路因子,并在细胞水平上进行标记验证。结果GC-2中与NC-KD(NC-OE)组相比,TUBB4B沉默和过表达后,CCP1在mRNA和蛋白水平上的表达均发生一致的性改变(P<0.05);同样CCP1敲减和恢复表达后与NC组相比,TUBB4B的表达也随之发生一致的性改变(P<0.05)。CCK8和流式细胞术实验发现TUBB4B敲减和过表达对GC-2的增殖速率和细胞的周期无明显改变。Western blot和细胞免疫荧光实验显示TUBB4B敲减和过表达后,细胞中核因子κB(NF-κB)信号通路关键蛋白:p65,p-p65与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路关键蛋白:ErK1/2,p-ErK1/2会发生相应的明显改变(P<0.05);而CCP1敲减后会明显影响PolyE表达(P<0.05)。结论在GC-2细胞中TUBB4B与CCP1表达相互调控为正向作用,且CCP1对TUBB4B具有去谷氨酰化修饰作用,TUBB4B参与初级精母细胞中NF-κB和MAPK信号通路的调控。

初探lncRNA-Tubb4b的蛋白编码能力及其对微管基因的调控

旨在探索长链非编码Tubb4b基因(lncRNA-Tubb4b)是否具有蛋白编码能力及其对Tubb4b基因的调控作用。本研究在lncRNA-Tubb4b中添加起始密码子ATG、0/1/2个的T尾和Flag标记,通过构建载体、脂质体转染和Western blot等技术对lncRNA-Tubb4b蛋白编码能力进行分析;随后,构建过表达载体和合成siRNA,通过脂质体转染和实时荧光定量PCR等技术检测lncRNA-Tubb4b对微管基因Tubb4b的影响。结果表明,我们扩增了添加0、1和2个T尾的Flag片段,其与lncRNA-Tubb4b融合后,成功构建到pcDNA3.1(-)载体中;转染小鼠精原细胞后发现,添加0、1和2个T尾的lncRNA-Tubb4b均没有FLAG蛋白条带;以pcDNA 3.1(-)-EGFP载体为对照,在小鼠精原细胞中过表达lncRNA-Tubb4b时,对照组细胞有荧光产生,试验组Tubb4b基因的mRNA表达水平极显著地降低(P<0.01);在小鼠精原细胞中干扰lncRNA-Tubb4b表达后,极显著地提高Tubb4b基因的mRNA表达水平(P<0.01)。这表明,lncRNA-Tubb4b确实不编码蛋白质,过表达或干扰lncRNA-Tubb4b的表达会极显著地降低或升高Tubb4b基因的表达。