基于DNA-BSA重测序和SSR技术的番茄ty-5基因分子标记的筛选

利用DNA-BSA重测序和SSR标记技术对番茄黄化曲叶病毒抗病基因ty-5开展定位研究。DNA-BSA重测序获得7个与番茄ty-5基因相关的侯选区域,分别位于1,4,9号染色体上,总长度为21.68Mb。利用SSR标记获得C_2at4g34700和SSR383标记,与番茄抗黄化曲叶病毒病基因ty-5紧密连锁,并且没有发现重组单株。最后,对DNA-BSA重测序和SSR标记结果联合分析,标记C_2at4g34700和SSR383位于重测序关联分析的1号和9号染色体的抗病关联区域附近。由此初步认定,这2个标记可以作为番茄抗黄化曲叶病毒病ty-5基因的分子标记。

番茄新品种黄化曲叶病毒病抗性基因Ty1、Ty3的分子标记

试验选取与番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty1和Ty3的紧密连锁的引物,利用SCAR标记对包头市农业科学研究所选育的番茄新品种TY191、TY192、TY196以及2016年参加全国区域试验的44个番茄新品种进行抗性基因Ty1和Ty3的鉴定。试验结果表明,番茄新品种TY191、TY192、TY196同时含有Ty1和Ty3抗性基因,与其他参试新品种相比有较强优势。

抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新品种“Ty191”的选育

“Ty191”是以S11为母本,TS30为父本的中早熟杂交一代番茄新品种。该品种果实粉红色,正圆形,单果质量约250 g。维生素C含量18.8 mg·(100g)^(-1),β-胡萝卜含量207μg·(100g)^(-1),总酸含量5.23 g·kg^(-1),可溶性糖含量6 g·(100g)^(-1),糖酸比11.47。色泽亮丽,红果,口味酸甜,抗裂果,质地硬,耐储运。含纯合Ty1和Ty3抗性基因,高抗番茄黄化曲叶病毒病,兼抗烟草花叶病毒病、枯萎病、叶霉病、根结线虫。耐热性强,适合于早秋、早春日光温室和大棚越夏栽培。2020年通过国家品种审认定,登记编号为GPD番茄(2020)150247。

多重PCR技术鉴定番茄Ty-2和Ty-3基因及田间验证

本研究采用多重PCR方法对与抗番茄黄化曲叶病毒病(tomato yellow leafcurl virus,TYLCV)的Ty-2和Ty-3基因紧密连锁的共显性SCAR标记进行扩增筛选,不同基因型(Ty-2/Ty-2,Ty-2/ty-2,ty-2/ty-2,ty-3/ty-3)的材料扩增出不同长度的特异片段,建立了一种快速检测抗TYLCV基因的技术。利用该技术对22份番茄材料进行检测,同时利用普通PCR对上述材料进行检测,两者结果完全吻合。最后用田间自然发病的方法在大田对这些材料抗性进行验证,符合率达86.4%。

CAPS标记在番茄抗黄化曲叶病毒病基因Ty1和Ty3遗传关系分析上的应用

以分别携带有Ty1/Ty1.Ty3a/Ty3a和Ty1/Ty1.Ty3/Ty3的番茄材料09(1)和09(2)为亲本的F2群体的89个单株为研究对象,利用分子标记的方法对F2群体所有单株的抗病基因型进行检测。结果发现,明显发生交换的单株有6个,占到F2群体89个单株的6.74%。表明Ty1位点与Ty3位点之间属于不完全连锁关系且连锁较紧密,为番茄抗病基因Ty1和Ty3(或Ty3a)的聚合育种提供一定的理论依据。

四重PCR技术鉴定番茄Ty-1、Ty-2、Mi和Cf-5基因研究

以番茄为试材,只利用1次PCR反应体系,同时对与番茄黄化曲叶病毒病(Tomatoyellow leaf curl virus)的Ty-1、Ty-2基因、番茄根结线虫病(Root-knot nematode)的Mi基因和番茄叶霉病(Leaf mold)的Cf-5基因紧密连锁的SCAR标记进行了筛选。结果表明:扩增的特异性片段和单引物扩增的片段吻合,即对与Ty-1基因、Ty-2基因、Mi基因和Cf-5基因紧密连锁的片段特异性扩增,所获得的片段大小分别是395、900、750和960bp。经TaqI酶切后所获得的特异性片段大小与前人试验所得大小基本相同,初步证明了四重PCR检测的准确性。该体系可对Ty-1、Ty-2、Mi和Cf-5 4个抗病基因进行同时筛选,在苗期辅助选择。降低了生产成本,节约时间、人力、物力,为分子标记辅助选择育种奠定了基础。

黄瓜属Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析

根据Tyl-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物，通过PCR扩增，从黄瓜属野生种酸黄瓜（Cucumishystrix Chakr．）和栽培黄瓜（CucumissativusL．）中均扩增出260bp左右的目标条带。扩增产物经纯化后克隆于pGEM-T Easy质粒载体，选择阳性克隆，再经菌落PCR鉴定，然后进行测序及序列分析，获得了21条来源于酸黄瓜和栽培黄瓜的逆转录酶序列，通过核苷酸聚类分为5个家族。这些核苷酸序列具有较高的异质性，主要表现为缺失突变，序列长度变化范围为255～272bp，同源性范围为27．0％～98．1％。翻译成氨基酸后，有4条序列出现终止密码子突变，6条序列表现出移框突变。将这些逆转录酶的氨基酸序列与已登录的不同物种同一类型逆转录酶的氨基酸序列进行聚类分析，表明它们可能有共同的起源。

甘草次酸衍生物TY501抗肺纤维化作用及机制研究

目的探索甘草次酸衍生物TY501对博莱霉素(BLM)诱导的肺纤维化模型大鼠的抗肺纤维化作用及初步机制。方法将40只大鼠随机分成5组:假手术组、模型组、吡非尼酮组、TY501高剂量组和低剂量组。经气道给予BLM制备大鼠肺纤维化模型,每天灌胃给予受试药。实验结束后,测定肺系数、氧分压(Pa O2),测定BALF中ALB、ALP、LDH以及肺组织中GSH、HYP含量,测定血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(COL4)含量。结果 1肺纤维化早期肺泡炎阶段相关指标:各治疗组与模型组相比,肺系数显著下降(P<0.05)、Pa O2明显升高(P<0.05);与模型组相比,各治疗组大鼠BALF中ALP、ALB以及LDH呈下降趋势(P<0.05);模型组肺组织匀浆中GSH含量反馈性增高,与假手术组相比存在明显差异(P<0.05),各治疗组较模型组含量降低(P<0.05);(2)肺纤维化晚期肺间质纤维化阶段:大鼠肺组织HYP、血清PCⅢ(TGF-β通路指标)、血清COL4(MMPs通路指标)含量,各治疗组较模型组呈下降趋势,差异有显著性(P<0.05)。结论 TY501对肺纤维化治疗存在价值,能够减轻BLM诱导的肺纤维化程度。TY501可能通过阻断TGF-β的作用、抑制MMPs等多途径抑制肺纤维化的发生,减轻肺纤维化症状。

多重PCR技术鉴定番茄Ty-1和Mi基因

利用同一PCR反应体系,对分别与番茄(Lycopersion esculentum)抗黄化曲叶病毒(Tomato YellowLeaf Curl virus)病的Ty-1基因和番茄抗根结线虫(root-knot nematode)的Mi基因紧密连锁的SCAR标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合。与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了303bp和95bp以及398bp、303bp和95bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点。与Mi基因紧密连锁的SCAR2标记也为共显性标记,抗感材料均产生750bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了570bp和180bp以及750bp、570bp和180bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点。酶切结果仍为750bp的产物。经反复验证,结果准确可靠,可以用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。

辣椒Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析

以辣椒属5个栽培种叶片为试材,利用Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的保守序列设计简并引物,PCR扩增后均获得了260bp左右的目的条带。对C.annuum的扩增产物进行纯化、克隆和测序,经Mega4和DNAstar软件分析后,获得25条逆转录酶序列,核苷酸序列长度变化范围为225～272bp,这些序列存在高度的异质性,主要表现为缺失突变,同源性范围为23.1%～93.2%,核苷酸聚类分为7个组。翻译成氨基酸后,有9条序列存在1～3个不同程度的终止密码子突变,4条序列存在移框突变。将这25条逆转录酶的氨基酸序列与已发表的不同物种同一类型逆转座子的逆转酶序列进行聚类分析,表明辣椒的Ty1-copia型逆转座子与烟草、矮牵牛、马铃薯有很近的关系。

不结球白菜Ty1-copia类逆转座子序列的克隆及表达

参照Tyl-copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物，分别从10个不结球白菜（Brassica campestris ssp．chinensis）品种的全基因组中均扩增出260bp左右的目标条带。将目的条带回收、克隆和测序后进行分析，DNAstar分析发现，这些序列存在高度的异质性，28个核苷酸序列变化范围为224～278bp，同源性范围为16．7％～83．0％。28条序列通过核苷酸聚类分为8个家族。推导氨基酸序列有移框突变、终止子突变或二者兼有；与已登录的不同物种同一类型逆转录酶氨基酸系统进化树分析表明，不结球白菜Tyl-copia类逆转座子与芥菜型油菜、拟南芥、芜菁、甜菜可能有共同的起源。半定量和实时定量PCR检测表明，水杨酸（salicylicacid）和Peronospora parasitica均能激活不结球白菜Tyl-copia类逆转座子，逆转座子在不结球白菜叶片中的表达特征说明它可能参与寄主对病原菌的抗性。

火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶序列的克隆及分析

【目的】克隆Ty3-gypsy类反转录转座子反转录酶(RT)序列并分析其特性,为火龙果遗传变异和进化研究提供新的信息。【方法】根据Ty3-gypsy类反转录转座子RT保守区设计简并引物,从红肉和白肉火龙果及其突变体中扩增出430 bp左右的目标片段,回收、克隆、测序获得RT序列,并进行生物信息学分析;采用RT-PCR检测其转录活性。【结果】共获得82条RT序列,其中有55条序列发生终止密码子突变,5条序列发生移码突变;经RT序列对比,火龙果与水稻、拟南芥有较高的同源性;3条RT序列具有转录活性。【结论】火龙果Ty3-gypsy类反转录转座子RT序列具有高度异质性,部分序列具有转录活性,与其他物种存在反转录转座子的横向传递。

转反义trxs基因小麦株系01TY18遗传分析及抗穗发芽特性

以豫麦18为受体导入反义trxs基因获得的株系01TY18(T0)为材料,运用PCR、实时荧光RT-PCR以及离体整穗发芽的方法,对反义trxs基因在转基因小麦中的遗传稳定性、基因表达和抗穗发芽特性进行了研究.结果表明,8个T1代转基因株系中有6个株系目的基因检测呈阳性,且在以后的世代中能够稳定遗传并呈典型的孟德尔单基因3∶1分离规律;反义trxs基因在6个转基因株系中能够正常表达且表现出显著的抗穗发芽特性.与非转基因对照相比,转基因株系穗粒发芽率和穗发芽度平均分别降低62%(P<0.01)和50.8%(P<0.01).

罗田甜柿Ty1-copia类逆转座子RNaseH-LTR序列的分离和特性分析

逆转座子序列信息的获得,对了解其在基因组中的行为及系统学研究有重要价值。本试验从罗田甜柿(Diospyros kaki Thunb.‘Luotian-tianshi’)基因组中分离出31个RNaseH-LTR(long terminal repeat,长末端重复)序列,并利用逆转座子间扩增多态性(inter-retrotransposon amplified polymorphism,IRAP)技术对部分序列相应的逆转座子家族在柿属植物中的转座活性及分布情况进行初步探讨。序列分析结果表明,至少有10个Ty1-copia类逆转座子家族得到扩增;其家族间普遍表现高度异质,碱基替换、插入或缺失突变,以及翻译成氨基酸后发生不同程度的终止密码子突变、氨基酸取代和移框突变等,是产生高异质性的原因;此外,其家族内部某些序列间的相似性极高,可能是寄主基因组与逆转座子间互惠关系的体现。应用部分逆转座子引物的IRAP分析结果表明,相应的逆转座子家族在柿属植物中普遍存在,其分布广泛,拷贝数高,转座活性强,具有进一步开发为多种逆转座子分子标记的潜力。

抗TY红果番茄新品种长丰10号的选育

番茄新品种长丰10号是以R025自交系为母本,以R018自交系为父本于2011年配制的杂交一代良种。无限生长红果类型,生长势强,叶片较大,中早熟。坐果率高,连续结果能力强,平均每667 m2产量7 600 kg左右。萼片基平,果实高圆形,果柄短,无绿色果肩,果脐小,表面光滑,外形美观。果实硬度好,耐贮运,货架寿命长,单果质量200 g左右,大小均匀。可溶性固形物含量5.7%,总糖3.34%,总酸0.335%。含有Ty-1、Ty-3基因,抗番茄黄化曲叶病毒病(抗TY)。适宜在陕西省及同等生态区日光温室和塑料大棚栽培。

利用多重PCR反应同时筛选番茄Ty-1和cf-5基因

利用同一PCR反应体系同时扩增、筛选分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-1基因和番茄抗叶霉病的cf-5基因紧密连锁的SCAR标记,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合。与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在TaqI酶切位点,酶切后分别产生了303bp和95bp以及398、303bp和95bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点,酶切后仍呈现398bp的特异带。与cf-5基因紧密连锁的SCAR2标记扩增后抗感材料均产生960bp的特异片段,用限制性内切酶TaqI酶切后,含cf-5基因的材料产生一条256bp的特异带,而不含cf-5基因的材料产生一条225bp的特异带。

含Ty-5基因番茄材料的引进、评价及利用

本文引进了含有Ty-5基因的栽培番茄材料,并对材料进行了抗性鉴定、评价及分子标记的检测,结果显示,Ty-5基因对TYLCV具有较高的抗性,该基因的利用为番茄新品种选育奠定了基础。

番茄抗病基因Ty-1的CAPS标记及检测

为了获得番茄抗病基因Ty-1的分子标记,利用特异引物对3份抗病纯合材料(基因型Ty-1/Ty-1)和3份感病纯合材料(基因型ty-1/ty-1)进行PCR扩增,抗病、感病材料均产生400bp的PCR扩增片段,感病和杂合抗病材料的酶切产物存在RsaⅠ酶切位点,酶切后分别产生了350、50bp以及400、350、50bp的片段,而抗病纯合材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为400bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对33份番茄F1进行检测,有20份材料含有抗病基因Ty-1,13份材料不含抗病基因Ty-1。利用该标记对国内的24份番茄自交系进行检测,24份材料均不含抗病基因Ty-1。经反复验证,结果准确可靠,该标记可以用于对番茄抗病基因Ty-1的筛选鉴定。

抗TY粉果番茄新品种郑番12158的选育

郑番12158是以自交系10Y153-混1为母本,以品11为父本配制而成的早熟番茄一代杂种。无限生长类型,生长势较强。7-8片叶着生第1花序,花序间隔3片叶。果实近圆形,幼果微具绿果肩,成熟果粉红色,果肉硬,连续坐果能力强。平均单果质量189g,平均畸裂果率6.9%,商品果率高。果实可溶性固形物含量4.9%,口感酸甜适中,品质优良。每667m2产量5433kg左右,含有抗番茄黄化曲叶病毒病的Ty-1基因及抗叶霉病的cf-9基因,综合抗性强。适合河南省春季和早秋保护地栽培。

番茄回交后代群体Ty-1和Ty-3的PCR鉴定

利用PCR反应体系,对番茄回交群体共862株进行番茄黄化曲叶病毒病(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)抗性基因Ty-1和Ty-3的鉴定。试验结果表明:44个BF1代分离群体中含有TYLCV抗性基因Ty-1的有43个,共387株,其中3个分离群体共49株中含有纯合Ty-1基因;含有TYLCV抗性基因Ty-3基因的分离群体有34个,共221株;同时含有TYLCV抗性基因Ty-1及Ty-3基因的材料有31个分离群体,共198株,本次试验使用的标记能够有效筛选出含有TYLCV抗性基因Ty-1和Ty-3的植株,为分子辅助育种提供参考依据。