CRISPR/AsCpf1双切刻系统构建初探

为了在CRISPR/AsCpf1系统的基础上构建双切刻系统,提高基因编辑特异性,本研究设计并构建Cpf1n(R1226A)、Cpf1-RRA(S542R/K607R/K949A)、Cpf1-RRAA(S542R/K607R/K949A/R1226A)3个突变体以及相应的crRNA表达载体,通过特定质粒组合与SSA-DKK2报告质粒共转染绵羊成纤维细胞,通过双荧光素酶检测的方式来验证DNA切割效率。结果显示:针对TTTV PAM的CRISPR/AsCpf1双切刻系统有DNA双链切割活性,但是单个的AsCpf1切口酶的DNA双链切割活性并未完全丧失;AsCpf1-RRA突变体针对TYCV PAM靶标具有一定的DNA双链切割活性;AsCpf1-RRAA突变体没有检测到针对TYCV PAM靶标的DNA双链和单链切割活性,但可能保留了DNA结合能力。本研究结果为后续高效CRISPR/Cpf1双切刻系统的开发与改进提供了重要参考。