敲降TYRP1基因对香猪表皮黑素细胞黑色素生成的影响

旨在探究酪氨酸相关蛋白酶1(tyrosinase related protein 1,TYRP1)对香猪原代表皮黑素细胞黑色素生成的影响。本研究选用具有“两头乌”毛色特征的3月龄健康香猪3头,每头猪采取头部黑色皮肤组织和背部白色皮肤组织。通过HE染色观察不同颜色香猪皮肤的毛囊结构及黑素细胞的分布特征;体外培养香猪原代表皮黑素细胞并通过多巴(L-Dopa)染色、实时荧光定量PCR和Western Blot方法进行鉴定;根据TYRP1基因序列构建5条siRNA,采用实时荧光定量PCR筛选出干扰效率最高的siRNA进行转染。成功干扰黑素细胞内TYRP1的表达后,分别通过实时荧光定量PCR、Western Blot、黑色素含量检测方法对黑素细胞内TYR、TYRP1及TYRP2的mRNA与蛋白相对表达量、细胞内总黑色素含量进行检测。结果显示,在香猪黑色和白色皮肤中都观察到完整的毛囊结构,黑素细胞主要分布在香猪黑色被毛皮肤中的毛囊外根鞘部位以及表皮。在MelM培养基作用下,黑素细胞生长旺盛,细胞形态、生长曲线、多巴染色、实时荧光定量PCR及Western Blot结果均表明培养的黑素细胞维持正常的生物学特性。敲降TYRP1后下调香猪表皮黑素细胞中黑色素生成相关基因TYR、TYRP1和TYRP2的mRNA和蛋白的表达,同时对黑色素的形成具有抑制作用。TYRP1基因能够影响香猪表皮黑素细胞黑色素的生成,研究结果可为探索TYRP1基因对香猪黑色素沉积的分子机制提供试验参考和基础数据。

牙鲆tyrp1a和tyrp1b的鉴定及tyrp1a与mmu-miR-143-5p_R+2的调控关系

为了研究牙鲆白化发生过程中的分子调控机制,本研究在获得正常和白化牙鲆转录组及micro RNA(mi RNA)深度测序数据的基础上,对tyrosinase related protein 1(tyrp1)和mmu-mi R-143-5p_R+2(mmu-143)进行了表达模式、靶基因预测及验证分析。首先通过RACE方法克隆得到白化相关基因tyrp1的2个转录本,进化树分析表明这2个转录本分别是tyrp1a和tyrp1b,利用RNAhybrid软件预测到mmu-143可能与tyrp1a基因存在互作关系,通过双荧光素酶实验初步验证了这一靶向关系。进一步的荧光定量结果显示,tyrp1a基因在正常牙鲆皮肤中的表达量显著高于白化牙鲆皮肤的表达量,正常牙鲆皮肤中mmu-143的表达量显著低于白化牙鲆皮肤中的表达量。本研究发现,牙鲆tyrp1存在2个转录本,分别是tyrp1a和tyrp1b。双荧光素酶实验和定量PCR分析初步证实,tyrp1a是mmu-143的靶基因,mmu-143是通过调控tyrp1a基因的表达来影响牙鲆白化的。此研究结果为深入揭示牙鲆白化发生的分子机制提供重要的基础资料。

不同羽色斑嘴野鸭毛囊中Tyr,Tyrp1及C-kit基因的表达及调控分析

斑嘴野鸭羽毛呈褐色,少数个体会呈现出黄白羽及白羽表型。Tyrosinase(Tyr)、Tyrosinase-related protein-1(Tyrp1)以及C-kit(The tyrosine kinase receptor)基因与黑色素合成密切相关,研究利用Real-time PCR对这3个基因在褐羽、黄白羽以及白羽3种表型斑嘴野鸭毛囊组织中进行表达分析;同时利用在线软件分别预测调控这3个基因的microRNA。结果发现,Tyr,Tyrp1在褐羽斑嘴野鸭中表达量最高,黄白羽中表达量显著下降(P<0.01),而在白羽中则完全不表达。C-kit在褐羽及黄白羽中表达量类似,而在白羽中表达则显著下降(P<0.01)。同时,预测到调控Tyr,Tyrp1和C-kit基因的microRNA数分别为9,25和18个。结果表明,毛囊组织中Tyr,Tyrp1以及C-kit基因的表达下调可能导致了斑嘴野鸭出现了黄白羽及白羽两种表型,这些候选microRNA可能参与了这3个基因的表达调控。

TYRP1基因控制动物色素形成的研究进展

黑色素广泛分布于微生物、植物和动物体内,并具有重要的生理功能。作者综述了黑色素的形成过程并详细分析总结了TYRP1基因特征及其变异对动物肤色的影响,为研究乌骨绵羊和乌骨鸡乌质性状形成的分子基础提供依据。

畜禽羽色候选基因ASIP和TYRP1的研究进展

羽色是畜禽重要的品种特征之一,是一种易观察的表型性状。畜禽的羽色性状由许多基因控制,其中目前研究较多的主要有黑素皮质素受体1(MC1R)、刺鼠信号蛋白基因(ASIP)、黑素亲和素(MLPH)、溶质载体家族(SLC24A5、SLC45A2)、酪氨酸酶(TYR)家族(TYR、TYRP1、TYRP2)等,各基因间相互作用形成了不同的羽毛颜色。本文简要介绍黑色素的形成机理及研究概况,并对畜禽羽色相关基因ASIP和TYRP1的遗传机制及研究进展进行综述,以便为进一步研究畜禽羽色形成的分子遗传机制提供参考。

黑线仓鼠及其白化突变系TYR、TYRP1的基因表达水平比较分析

目的本研究旨在研究TYR、TYRP1基因在黑线仓鼠与白化突变系皮肤组织中的表达情况,探索其与白化毛色性状的产生是否具有相关性。方法以黑线仓鼠和白化突变系皮肤组织为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术,分别得到黑线仓鼠与白化突变系TYR和TYRP1基因的相对表达量。结果黑线仓鼠皮肤中的TYR和TYRP1基因的mRNA相对表达量分别是白化突变系皮肤组织中的2.5倍和5.3倍。结论表明黑线仓鼠皮肤中TYR、TYRP1的基因表达水平存在表达差异,白化突变系TYR、TYRP1基因发生表达下调,揭示出了TYR、TYRP1基因的表达量与白化突变系白化性状的产生有关。

獭兔酪氨酸酶相关蛋白1(Tyrp1)基因序列分析及外显子多态性研究

[目的]探索獭兔酪氨酸相关蛋白1(Tyrp1)基因在毛色形成过程中的分子机制。[方法]对獭兔Tyrp1基因序列的核苷酸序列、编码产物的基本理化性质等进行预测和分析,同时利用PCR-SSCP(Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products)技术检测Tyrp1基因CDS序列的多态性分布状况。[结果]信息学分析发现,TYRP1蛋白是不稳定的亲水性蛋白,有信号肽,具有酪氨酸酶家族特征性功能结构域。多态性检测发现仅在Tyrp1基因CDS的483 bp处存在1个C→T的同义突变,位于外显子2上,该碱基的突变没有造成氨基酸的改变(AUC→AUT,异亮氨酸)。Hardy-Weinberg平衡检验表明,青紫蓝色獭兔群体处于非平衡状态,白色獭兔群体处于平衡状态。青紫蓝兔群体为中度多态信息含量(0.25<PIC<0.50),白色獭兔群体为低度多态信息含量(PIC<0.25)。[结论]Tyrp1基因对獭兔的毛色有一定的影响。该研究结果可为獭兔毛色的选种选育提供一定的参考。

动物毛色候选基因TYRP1的研究进展

就TYRP1基因及其编码蛋白的结构和功能、多态性及在不同组织中的差异表达与毛色形成的关系进行了概述,并对今后在TYRP1基因方面的研究进行了展望。

黑貉TYRP1基因的克隆及生物信息学分析

为探明黑貉酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1,TYRP1)基因CDS序列并对其进行生物信息学分析,试验采集黑貉背部皮肤组织提取RNA后反转录为cDNA,根据GenBank中犬科TYRP1基因mRNA序列(登录号:NM_001194966.1)设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增TYRP1基因CDS区,将其插入到克隆载体中,对阳性菌落经PCR验证和序列测定后进行生物信息学分析。结果显示,黑貉TYRP1基因CDS序列全长为1 614 bp,编码537个氨基酸,所编码蛋白属于不稳定可溶性的亲水蛋白质。TYRP1基因与狐的遗传距离较近,说明该基因在不同物种及进化过程中具有高度保守性。TYRP1蛋白二级结构中,无规则卷曲所占比例最高,为54.0%;α-螺旋次之,为29.8%。TYRP1蛋白三级结构主要由大量无规则卷曲和α-螺旋构成,与二级结构相一致。TYRP1蛋白具有氧化还原酶活性,参与DNA修复和复制、蛋白质合成和降解,可与TYR、DCT、TP53、TRPC1等多种蛋白相互作用。本试验结果为进一步探索TYRP1基因在哺乳动物毛色遗传机制中的功能提供了理论依据。

TYRP1和MLANA影响朗德鹅羽色形成的机制研究

研究旨在确定羽色形成的关键候选基因,为筛查鹅羽色的控制基因提供有用信息。利用1月龄和2月龄灰、白羽朗德鹅皮肤样品(n=12),通过定量PCR测定MLANA、TYRP1、MC1R、ASIP和SLC45A2基因的m RNA表达量。从血细胞中提取基因组DNA,通过测序检测MLANA和TYRP1基因上游序列的核酸多态性。结果显示:在1月龄样品中,ASIP基因表达量在灰、白羽间无显著差异,而其他基因的表达量均存在显著差异(P<0.05),且白羽低于灰羽。2月龄时,MC1R和SLC45A2基因的表达量在羽色间无显著差异,但白羽中的ASIP基因表达量显著高于灰羽(P<0.05)。与1月龄相一致,白羽中MLANA和TYRP1的表达量均显著低于灰羽(P<0.05)。此外,MLANA和TYRP1的上游调控序列中并未发现核酸多态性。结果表明:MLANA和TYRP1基因所在的信号通路对鹅灰、白羽形成至关重要,白羽的TYRP1表达缺失可能受αMSH/MC1R分支以外的其他信号通路分支影响。

基于tyrp1a转基因斑马鱼构建色素障碍性疾病药物筛选模型

为了能够有效地筛选治疗色素障碍性疾病药物,建立一种转基因斑马鱼药物筛选模型。采用斑马鱼酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1a,tyrp1a)基因启动子驱动绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),构建出tyrp1a转基因斑马鱼,使绿色荧光能够特异性表达在斑马鱼黑素细胞部位。分别给予斑马鱼促进黑素合成的药物N-苯基硫脲(Nphenylthiourea,PTU)和抑制黑素合成的药物黑素细胞刺激素(alpha-melnaocyte stimulating hormone,α-MSH),检测药物对斑马鱼黑素合成和绿色荧光蛋白表达影响。结果显示,PTU可以抑制斑马鱼黑素细胞黑素合成作用,并且降低转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达。α-MSH可以促进斑马鱼黑素细胞黑素合成作用,并促进转基因斑马鱼绿色荧光蛋白表达。本研究成功地建立了一种新的可以用于色素性障碍疾病药物筛选的转基因斑马鱼模型。

英国史宾格犬酪氨酸关联蛋白1(TYRP1)基因多态性及单倍型研究

探讨英国史宾格犬毛色与酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）基因的相关性。本研究采用DNA测序技术、AS-PCR以及PCR-RFLP对英国史宾格犬群体的TYPR1基因编码区进行多态性检测和基因分型,分析多态位点间的关系。结果表明：TYRP1基因编码区存在3个多态位点,T121A和P345△2个多态位点基因型频率分布符合H-W平衡,C991T位点基因型频率分布不符合H-W平衡。经χ~2独立性检验,T121A和P345△多态位点与犬2种毛色极显著相关（P〈0.01）;C991T位点与犬2种毛色显著相关（P〈0.05）。3个多态位点两两间连锁不平衡分析发现连锁不平衡系数｜D′｜值都为1。3个多态位点构成3种单倍型：AC△、TTP和TCP;得到6种单倍型组合,每一种单倍型组合决定犬特定的毛色类型。因此,本研究成功建立了犬毛色基因TYRP1编码区多态位点的检测方法,为进一步研究毛色基因型与犬的胆量大小的相关性提供了前期工作基础。

中国黄牛酪氨酸关联蛋白1(TYRP1)基因多态性的研究

[目的]验证TYRP1基因的错义突变(g.1300C>T)与中国黄牛毛色性状是否存在相关性。[方法]采用PCR测序及生物信息学的方法,对991头中国黄牛、48头安格斯牛、104头婆罗门牛的TYRP1基因进行多态性分析。[结果]通过对中国黄牛的等位基因频率和基因型频率的分析,发现此变异与中国黄牛棕色毛色性状不相关。[结论]TYRP1基因的错义突变(g.1300C>T)与中国黄牛棕色表型不相关。该位点可能在一些品种中受到了选择,中国黄牛的棕色表型可能受其他基因调控。

中国家驴TYRP1基因第二内含子多态性分析

为了探究TYRP1基因对中国家驴毛色的影响,试验采集410只不同毛色中国家驴的血液样本,采用聚合酶链式反应及单链构象多态性(polymerase chain reaction and single-strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)方法检测中国家驴TYRP1基因第二内含子中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,对不同毛色中国家驴个体进行基因分型,并计算基因型频率和等位基因频率,分析TYRP1基因第二内含子多态性与中国家驴不同毛色之间的关系。结果表明:在中国家驴TYRP1基因第二内含子中检测到1个SNP位点(g.1 702A→G),该位点存在AA、AG、GG三种基因型;乌头、黑三粉、青三粉、灰三粉、白色和白化家驴的优势等位基因均为A。乌头、黑三粉和青三粉均为AA基因型频率最高,GG基因型频率最低;灰三粉为AA基因型频率最高,AG基因型频率最低(0)。在乌头、黑三粉、青三粉、灰三粉家驴中,AA基因型频率为灰三粉最高,然后依次为青三粉、黑三粉和乌头;以黑毛色为主色调的家驴(乌头、黑三粉、青三粉)GG基因型频率低于以灰毛色为主色调的家驴(灰三粉),有白毛混杂的黑三粉和青三粉的GG基因型频率低于纯黑的乌头。样本中的白色家驴和白化家驴各有2头,其基因型均为AA纯合子。说明随着中国家驴黑色被毛比例的增加,TYRP1基因g.1 702A→G位点的AA基因型频率逐渐降低,推测该位点可能与中国家驴毛色性状有关。

水貂TYRP1基因的多态性与毛色性状的相关性分析

为了研究水貂TYRP1基因多态性与毛色性状的相关性,试验首先提取384只水貂的血液基因组DNA,然后对水貂TYRP1基因外显子2,3,4进行PCR扩增并测序,通过序列比对识别单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点并进行基因分型,统计SNP位点在不同品种水貂群体(红眼白水貂、银蓝水貂、短毛黑水貂和咖啡水貂)中的基因型频率和等位基因频率后进行遗传多样性分析,最后采用卡方(χ^(2))检验对SNP位点基因型与毛色性状进行相关性分析。结果表明:TYRP1基因外显子3,4未识别到SNP位点,而外显子2识别到1个SNP位点(C777G位点),C777G位点在4个品种水貂群体中共存在3种基因型(CC型、CG型和GG型)。红眼白水貂群体的优势基因型为GG型,优势等位基因为G;银蓝水貂、短毛黑水貂和咖啡水貂群体的优势基因型均为CC型,优势等位基因均为C,其中短毛黑水貂群体的基因型全部为CC型,等位基因全部为C。C777G位点在红眼白貂和银蓝水貂群体中极显著偏离哈代-温格平衡状态(P<0.01),在咖啡水貂群体中处于哈代-温格平衡状态(P>0.05)。红眼白、银蓝和咖啡三个品种水貂TYRP1基因C777G位点为轻度多态(PIC<0.25),短毛黑水貂TYRP1基因C777G位点无多态性(PIC=0)。4个品种水貂TYRP1基因C777G位点的纯合度(Ho)在0.6957(咖啡黑水貂)~1.0000(短毛水貂)之间,杂合度(He)在0(短毛黑水貂)~0.3043(咖啡水貂)之间,有效等位基因(Ne)在1.0000(短毛黑水貂)~1.3478(咖啡水貂)之间。C777G位点基因型与红眼白、银蓝和咖啡三个品种水貂毛色性状极显著相关(P<0.01)。说明TYRP1基因C777G位点可作为水貂毛色性状辅助选择的分子标记。

红褐色乌苏里貉TYRP1基因的克隆及表达水平分析

实验旨在探讨红褐色乌苏里貉和野生型乌苏里貉TYRP1基因的核酸序列以及表达水平差异。本实验克隆了红褐色和野生型乌苏里貉TYRP1基因CDS序列,并利用实时定量PCR技术对TYRP1基因在2种毛色貉中的mRNA表达水平进行了分析。结果表明:2种貉TYRP1基因CDS序列全长1 614 bp,包括完整的开放阅读框,共编码537个氨基酸;红褐色乌苏里貉TYRP1基因编码序列与狗、猪、绵羊、小鼠、人、牛、猫、马、虎鲸和黑猩猩核酸序列高度同源,同源性分别为99.07%、90.56%、89.64%、83.22%、88.90%、89.39%、90.87%、88.63%、90.25%和88.65%,与野生型乌苏里貉序列完全相同。利用SPSS软件进行独立样本t检验,结果表明TYRP1基因在2种貉皮肤组织中均可稳定表达,利用F=(1+E)-△△Ct计算可知TYRP1基因在红褐色乌苏里貉中的表达量是野生型乌苏里貉的0.93倍,但差异不显著(P>0.05)。该实验为TYRP1基因的功能分析及红褐色乌苏里貉毛色突变分子遗传机制的探讨提供了一定的理论基础。

水貂TYRP1基因启动子活性和Sp1结合位点

以同源性较高的雪貂TYRP1基因序列（Gen Bank：NW_004569257．1）为模板，通过PCR扩增7个不同长度的启动子缺失片段，定向克隆至pGL3-Basic载体中，利用脂质体转染到A375和293T细胞，通过双荧光素酶检测系统检测活性，利用多个在线软件分别分析启动子区活性及转录因子结合位点，并构建突变体进行活性验证。结果显示：成功构建7个不同长度的启动子缺失片段重组质粒，其中6个片段具有明显的启动子活性。-367／＋70区域为水貂丁豫．P1基因核心启动子区域，-367／-144区域的缺失，启动子活性无明显变化，-144／-37区域的缺失使启动子活性明显下降，表明该区域可能存在正调控元件。通过生物信息学方法预测可能存在Spl转录因子结合位点，构建的Mut-Spl-2突变体活性明显低于野生型pGL3—215，差异极显著（P〈0．01）。结果表明：成功筛选了水貂TYRPl基因核心启动子区域（-367／＋70），确定Spl（-56／-45）结合位点为转录的正调控区域。

银黑狐TYRP1基因CDS区鉴定及生物信息学分析

为了探明酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）基因对狐狸毛色的调控机制，本研究利用RT-PCR、染色体步移和核酸测序等技术，获得了银黑狐TYRP1基因完整编码区（coding DNA sequence，CDS），利用ProtParam和PredictProtein等在线软件对该基因进行了生物信息学分析，并利用Lasergene7．1软件包进行银黑狐与其他物种间的同源性分析及系统进化树的构建。结果表明，银黑狐TYRP1基因CDS区共计1614bp，编码537个氨基酸残基，属于不稳定可溶性亲水蛋白质。亚细胞定位主要在内质网和高尔基体中，属于分泌蛋白。在第24和25个氨基酸之间存在1个裂解位点，存在信号肽。其属跨膜蛋白，包括跨膜域、胞外域和胞内域3个部分。二级结构以无规则卷曲为主（59．03％），α-螺旋占22．91％，属卷曲蛋白质。三级结构与二级结构预测结果基本一致，主要是由无规则卷曲和α-螺旋构成。银黑狐与其他10个物种间的相似度为88．6％～99．6％，说明物种之间同源性较高，TYRP1基因编码区在进化过程中保守性较强。系统进化分析提示，银黑狐与赤狐和家犬的遗传亲缘关系最近。银黑狐TYRP1基因编码区的成功获取及分析为进一步探讨其在毛色形成过程中的功能研究提供了较好的理论依据。

北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P<0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。

绵羊黑色素合成相关基因的研究进展

毛色是一种可利用的遗传标记。在确定杂交组合、品种纯度和亲缘关系以及评价产品质量等方面均有一定的用途。哺乳动物毛色是由黑色素细胞产生的真黑素和褐黑素二者的分布和比例决定的。控制哺乳动物毛色色素的基因有很多,着重对黑色素合成相关基因酪氨酸酶基因(TYR)、黑素皮质激素受体1基因(MC1R)、鼠灰信号蛋白基因(Agouti)、酪氨酸酶相关蛋白1基因(TYRP1)的生物学功能及其遗传变异机制进行了综述。