过量表达小麦TaCYP78A5增加花器官的大小

【目的】利用表达模式分析、转基因过表达和细胞学观察等策略,解析TaCYP78A5调控花器官大小的功能和机制,为作物遗传改良提供基因资源和理论基础。【方法】根据EnsemblPlants基因组数据库中不同物种CYP78A家族成员的序列信息,对小麦TaCYP78A5和其他物种中的同源基因进行序列比对和进化分析;利用生物信息学分析小麦TaCYP78A5的基因和蛋白结构,以及不同器官的表达模式;通过在拟南芥中组成型过表达和生殖器官局部特异性过表达TaCYP78A5的策略,明确TaCYP78A5具有调控花器官大小的功能;利用显微镜观察不同转基因拟南芥花器官的细胞学特征,解析TaCYP78A5调控花器官大小的细胞学机制;利用小麦转基因过表达策略,明确TaCYP78A5调控小麦穗部大小等其他穗部性状的功能;利用323份小麦品种的单倍型数据与穗部表型数据进行关联分析,探析不同小麦品种TaCYP78A5表达量的高低对穗部大小等其他穗部性状的影响。【结果】小麦TaCYP78A5与拟南芥AtCYP78A5的基因和蛋白序列相似性较低,但基因和蛋白结构相似性较高。小麦TaCYP78A5和拟南芥AtCYP78A5均在多个器官广泛表达,但在花器官中表达量最高。相较于野生型,在拟南芥中组成型过表达TaCYP78A5能导致花器官增大,花瓣面积显著增加13.5%—35.4%;而且仅在胚珠局部特异性过表达TaCYP78A5也足以导致拟南芥花器官增大,花瓣面积显著增加9%—22.1%;相反,拟南芥cyp78a5突变体的花器官则显著小于野生型,花瓣面积显著减少27%。在拟南芥中组成型过表达TaCYP78A5导致花瓣表皮细胞大小较野生型显著增加49%—54%,细胞数目较野生型显著减少11%—19%,局部特异性过表达TaCYP78A5也导致花瓣表皮细胞大小较野生型显著增加20%—49%,细胞数目较野生型显著减少8%—24%。在小麦中组成型过表达TaCYP78A5导致小麦穗长增加7.9%—8.9%,颖壳面积增大9.6%—14.7%,穗粒数增加12.4%—23.8%,小穗数和小穗粒数呈现不同程度的变化。单倍型分析结果显示,在323份小麦品种中,具有较高TaCYP78A5-A表达量的小麦品种比具有较低TaCYP78A5-A表达量的小麦品种的穗长更长,小穗粒数更多,小穗数更少,而穗粒数无显著差异。【结论】TaCYP78A5以一种非细胞自制的模式促进花器官生长,小麦和拟南芥过量表达该基因均能导致花器官的增大。

小麦粒重相关基因TaCYP78A5功能标记开发及验证

为了开发小麦粒重相关基因TaCYP78A5(Triticum aestivum Cytochrome P450 78A5)的功能标记,挖掘与千粒重性状相关的优异等位变异,本研究通过对30份不同品种小麦TaCYP78A5启动子区测序及比对鉴定,并根据SNP位点差异开发TaCYP78A5-2A启动子区功能标记CAPS-5Ap。结果表明,在30份不同小麦品种中TaCYP78A5-2A启动子区域出现5个SNP位点差异,可将30份不同品种小麦分为TaCYP78A5-2Ap-HapI和TaCYP78A5-2Ap-HapII两种单倍型;以323份现代育成小麦品种验证发现,TaCYP78A5-2Ap-HapI的分布频率为17.96%,TaCYP78A5-2Ap-HapII的分布频率为82.04%,表明CAPS-5Ap标记可用于小麦TaCYP78A5-2A启动子序列2种单倍型的鉴定。此外,关联分析发现,CAPS-5Ap标记与粒重相关,且TaCYP78A5-2Ap-HapII是提高千粒重的优异单倍型。研究结果为小麦分子标记辅助选择和性状改良提供理论依据。

TaCYP78A5基因过表达小麦的遗传和功能初步分析

为了验证小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A5在小麦籽粒发育中的功能,对pINO启动子驱动的TaCYP78A5基因过表达的转基因小麦后代株系进行了鉴定,检测了T_0代植株目标基因拷贝数,定量分析了7个T_1代阳性植株的目标基因表达,并对其籽粒大小进行了统计。结果表明,利用Bar试纸条和目标基因特异PCR检测相结合的方法对21株转基因T_0代再生苗进行检测,共鉴定出14个阳性植株,除2个植株的目标基因拷贝数为3和1个植株为7外,其余11个T_0代转基因植株目标基因插入拷贝数均为1~2个,其中有6个单拷贝植株。与野生型相比,7个T_1代阳性植株目标基因表达量均极显著增加,粒厚和粒宽均有不同程度增加,粒重极显著增加。

小麦TaCYP78A5基因的克隆及生物信息学分析

细胞色素P450(Cytochromes P450)蛋白家族含有硫羟基和血红素结构域,参与多种生物合成,CYP78A家族成员对籽粒大小形成有重要的功能。利用同源克隆的方法,分别从小麦大粒品系‘P271’和小粒材料‘中国春’中扩增到位于2AS、2BS、2DS上的TaCYP78A5-2A、TaCYP78A5-2B和TaCYP78A5-2D基因,编码534、544、549个氨基酸。通过分析发现在‘P271’和‘中国春’克隆到的TaCYP78A5序列一致,说明TaCYP78A5基因在这2个粒型的小麦中是保守的。CYP78A家族在水稻和拟南芥中具有非自主性细胞表达模式,结合对CYP78A家族的生物进化关系研究发现,CYP78A家族的各个基因在单子叶植物中是保守的。‘P271’和‘中国春’籽粒大小的差异,可能是TaCYP78A5基因在‘P271’中的基因表达量高于‘中国春’,引起种子发育过程中内表皮细胞的增殖,从而促进种子表皮增大,使得‘P271’种子大小和质量增加。

小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A17的功能标记开发

籽粒大小是影响小麦产量的重要因素之一。为了开发小麦籽粒大小相关的功能标记,本研究克隆得到一个潜在籽粒大小相关基因TaCYP78A17,并对其进行了系统进化、表达模式、等位变异分析和功能标记开发。结果表明,TaCYP78A17基因是小麦细胞色素P450 CYP78A家族的一员,且在小麦幼穗和籽粒中高表达;在30份普通小麦品种中发现TaCYP78A17-Ap存在6个SNP和2个InDel;根据InDel 4和InDel 8开发功能标记InDel-A17,可将30份普通小麦品种分为TaCYP78A17-Ap-HapⅠ, TaCYP78A17-Ap-HapⅡ和TaCYP78A17-Ap-HapⅢ三种单倍型;利用该功能标记在323份普通小麦品种中进行验证,发现该功能标记可以有效区分上述3种单倍型;表型调查发现具有TaCYP78A17-Ap-HapI单倍型的小麦其千粒重和籽粒大小显著高于具有TaCYP78A17-Ap-HapⅡ或TaCYP78A17-Ap-HapⅢ单倍型的小麦。研究结果有望应用于小麦分子标记辅助选择育种。