导入TaNHX2基因提高了转基因普那菊苣的耐盐性

我国部分地区土地盐碱化的日益严重,对作物的生长和生态环境产生了显著影响,因此通过植物基因工程手段培育耐盐碱的转基因作物品种对改善作物的生存能力和生态环境,提高作物产量具有重要的意义。采用农杆菌介导法将来自小麦(Triticum aestivum Linn)的Na+/H+逆向转运蛋白的基因(vacuolar Na+/H+exchanger or antiporter,简称NHX、NHE或NHA),对普那菊苣(Cichorium intybus L.cv.Puna)植株进行了遗传转化。经抗生素筛选以及针对TaNHX2基因的PCR检测和Southern杂交分析,证明获得了28株转TaNHX2基因的普那菊苣植株。用不同浓度NaCl溶液对普那菊苣野生型和T0代种子、愈伤组织和幼苗生长情况胁迫的研究,结果表明:转TaNHX2基因普那菊苣植株表现出一定的抗性,比野生型明显提高。在300 mmol/LNaCl胁迫下转基因植株种子的出芽率、外植体出愈率和分化率是野生型植株的2—4倍,而500 mmol/L NaCl浓度为野生型和转基因外植体能否生长的临界点。在此临界值下野生型外植体或不能形成愈伤组织、或幼苗不能正常生根、或已生根幼苗不能正常成长,而转基因外植体可以继续形成愈伤组织并正常生根生长。同时对500 mmol/L NaCl胁迫下野生型和转基因普那菊苣幼苗其体内丙二醛含量(MDA)、过氧化氢酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性进行测定,结果表明转基因植株比野生型植株的MDA含量降低了1—3倍,POD活性提高了1—3倍,SOD活性提高了2—3倍,分析发现普那菊苣的耐盐性与其体内的丙二醛含量(MDA)、过氧化氢酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性密切相关。

盐胁迫对转TaNHX2基因玉米幼苗生长的影响

采用Hoagland营养液水培方法,研究了不同浓度NaCl胁迫条件下,转TaNHX2基因玉米自交系昌7-2和非转基因对照的幼苗生长情况、植株形态和生理指标的差异。结果显示,转基因玉米植株表现出一定的抗逆性,生长状况明显优于对照;随着盐胁迫浓度的增加,转基因和非转基因玉米植株株高、根长、鲜质量、干质量和叶绿素含量逐渐下降,丙二醛含量逐渐上升,但是转基因玉米的变化幅度较小;在几乎所有胁迫浓度下,转基因玉米植株的株高、根长、鲜质量、干质量、叶绿素含量均显著高于非转基因植株,丙二醛含量均比非转基因植株低。以上结果说明,转TaNHX2基因玉米幼苗的耐盐性明显优于非转基因对照。

根癌农杆菌介导合欢转TaNHX2基因体系的优化

通过对农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等影响转化效率的因素进行优化,建立了合欢农杆菌转化体系。在此基础上,利用农杆菌介导法将TaNHX2基因导入合欢基因组内,获得大量Kan抗性再生植株。常规PCR和实时荧光PCR检测结果表明,外源基因已整合到合欢基因组中,并正常转录。

转TaNHX2基因大豆的抗旱性鉴定

本研究利用转TaNHX2基因大豆T3代株系,研究其在干旱胁迫情况下表型、生理特性、生物量与光合作用等方面的变化。结果表明:随着干旱时间的不断延长,对照表现出明显的萎蔫,且转基因植株能够持续地保持绿色状态。转基因植株叶片中含水量高于对照,但株系间叶绿素和可溶性糖含量差异不大,转基因植株中的脯氨酸和丙二醛含量明显低于对照,SOD的活性高于对照。综合评价表明转TaNHX2基因大豆T3代株系比对照具有更强的耐旱性。

TaNHX2基因植物表达载体的构建及在烟草中的表达

将TaNHX2基因重组于质粒pBIN438的CaMV 35S启动子下游,构建含TaNHX2基因的植物双元表达载体pBIN438-TaNHX2.采用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tobacum L.),获得含TaNHX2的转基因烟草植株.经PCR、RT-PCR分析表明,TaNHX2基因已整合到烟草中,并且得到表达.耐盐分析表明,外源基因TaNHX2提高了转基因植株的耐盐性.

过量表达TaNHX2基因提高转基因棉花的抗旱耐盐性

液泡膜Na^(+)/H^(+)反向转运蛋白在调节离子平衡,提高植物耐盐耐旱方面起着重要功能。为了研究液泡膜Na^(+)/H^(+)反向转运蛋白基因TaNHX2在棉花耐盐耐旱中的作用,以晋棉7号为受体,利用农杆菌介导法将克隆自小麦的TaNHX2基因转入棉花愈伤组织,通过组织培养胚状体发生途径获得转基因再生植株。以0.5%卡那霉素对再生苗筛选后,利用PCR和RT-PCR进行分子检测,证实外源基因已导入棉花并正常表达。在温室盆栽条件下,于4片真叶期对转TaNHX2基因棉花及其野生型对照施加NaCl或PEG胁迫处理,处理10天后发现盐胁迫或干旱胁迫显著抑制了棉花光合作用,提高了丙二醛(MDA)含量;转TaNHX2基因棉花的光合速率(Pn)显著高于野生型,MDA含量显著低于野生型;转TaNHX2基因棉花在盐旱胁迫后,叶片和根系中的Na^(+)含量显著低于野生型对照。这些结果说明:在棉花中过量表达TaNHX2基因,盐旱胁迫下可以降低转基因棉花的Na^(+)含量,提高光合速率,降低MDA含量,从而提高转基因棉花的耐盐抗旱能力。

农杆菌介导普那菊苣遗传转化体系的建立

以普那菊苣(Cichorium intybus L.cv.Puna)叶片为试验材料,接种于含不同激素浓度配比的MS培养基上进行愈伤组织、芽分化以及根再生的诱导,分析了不同激素浓度及其配比对愈伤组织诱导和芽分化以及根再生效果的影响。以已经建立的再生体系为基础,以农杆菌菌株LBA4404(含质粒pBin438-TaNHX2)侵染转化普那菊苣,探索普那菊苣高效遗传转化体系。结果表明:对外植体适宜的预培养时间为2～3d,与农杆菌的共培养时间也应控制在2～3d;侵染时间控制在8min左右;卡那霉素(Km)阳性筛选的适宜选择浓度为60mg.L-1。乙酰丁香酮(AS)200μmol.L-1是促进农杆菌转化的最佳浓度,200 W超声波处理、20次负压处理也可提高农杆菌转化率效果。26mg.L-1 Km是野生型普那菊苣苗能够存活的上限,头孢唑林钠和头孢噻肟钠在500～1000mg.L-1浓度范围内、羧苄青霉素300mg.L-1和氨苄青霉素在40～60mg.L-1浓度范围内均能较好的诱导出愈伤组织和芽。将来自小麦(Triticum aestivum)的Na+/H+逆向转运蛋白(vacuolar Na+/H+exchanger or antiporter,简称NHX,NHE或NHA)导入普那菊苣;经抗生素筛选以及针对TaNHX2基因的PCR检测和Southern杂交分析,证明获得了28株转TaNHX2基因的普那菊苣植株。

TaNHX_2基因植物表达载体的构建及在拟南芥中的功能分析

将TaNHX2基因重组于质粒pBIN438的CaMV 35S启动子下游,构建含TaNHX2基因的植物双元表达载体pBIN438-TaNHX2。采用根癌农杆菌介导的真空渗透法转化拟南芥,得到T0代转基因拟南芥种子。经含Kan的平板筛选及PCR鉴定,获得54株阳性植株,选取生长一致的转基因阳性植株进行耐盐、耐旱分析,结果表明TaNHX2能够提高转基因植株的耐盐性和耐旱性。