小麦转录因子TaSIM的原核表达分析

为了进一步研究TaSIM基因的功能,以pJET1.2-TaSIM质粒为模板,PCR扩增TaSIM基因的cDNA编码区,构建了该基因的原核表达载体pET-28a-TaSIM,经菌液PCR和测序鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。结果表明,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的TaSIM蛋白,大小约为33 kDa。SDS-PAGE电泳分析表明,最佳诱导表达条件为0.5 mmol/L IPTG在37℃下诱导2 h。

小麦TaSIM基因结构及表达分析

根据小麦TaSIM基因的cDNA序列设计引物,采用PCR技术从小麦中克隆TaSIM基因的DNA序列,采用半定量RT-PCR方法研究TaSIM基因在不同组织中的表达。结果表明:TaSIM编码区DNA序列长度为2 355bp,包含2个外显子和1个内含子。分析发现内含子富含AT,在内含子中发现2个MYB转录因子结合位点。半定量RT-PCR检测表明,TaSIM基因在不同组织中均有表达,在雄蕊中的表达量最高。TaSIM表达量依次为雄蕊>雌蕊>根>茎>叶。

小麦TaSIM蛋白的原核表达与纯化及Western blotting检测

为了获得TaSIM(Salinity-induced R2R3-MYB)基因的纯化蛋白,以便研究TaSIM转录因子的DNA结合特异性。本研究以含有pET28a-TaSIM原核表达载体的大肠杆菌BL21为材料,用0.5 mmol/L IPTG,在37℃诱导TaSIM融合蛋白表达2 h,收集上清液,采用Ni-NTA柱纯化含有His标签的TaSIM融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测结果表明获得了分子量大小约为33 kD的TaSIM融合蛋白。采用Western blotting检测TaSIM融合蛋白的表达,以鼠抗血清和辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠Ig G为抗体,结果表明TaSIM融合蛋白能够和抗体特异结合,说明诱导的蛋白是TaSIM融合蛋白。研究结果为进一步利用凝胶阻滞方法检验TaSIM蛋白与顺式作用元件的结合提供实验基础。