猪带绦虫乳酸脱氢酶基因的序列分析、克隆表达和免疫学分析

目的利用生物信息学方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中识别乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A),分析和预测其编码蛋白的结构和功能,并对其进行克隆表达和免疫学特性研究。方法利用NCBI和ExPASy中有关基因、蛋白的序列和结构信息分析工具,结合其它生物信息学分析软件包,从猪带绦虫成虫全长cDNA质粒文库中识别乳酸脱氢酶A(TsLDH-A)的基因及其编码区,分析、预测该基因编码的蛋白的结构与功能;并将TsLDH-A克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中诱导表达,表达产物经纯化后用蛋白印迹(Western Blotting)进行免疫学分析。结果该基因全长1 332bp,编码331个氨基酸。其氨基酸序列与其它物种LDH-A氨基酸序列一致性可达54%,具有乳酸脱氢酶保守结构域。其编码的蛋白理论分子量为3 5461.1Da,有3个跨膜区和多个磷酸化位点,蛋白的理化性质较稳定。预测有4个主要的B细胞抗原表位,L-乳酸脱氢酶活化位点之一的His192包含于表位190-199aa中。酶催化位点的3个关键氨基酸在空间结构上相互靠近。PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-TsLDH-A构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白能被TsLDH-A重组蛋白免疫的SD大鼠血清、感染了猪带绦虫的病人血清及猪血清识别,表明其具有较好的免疫原性和免疫反应性。结论应用生物信息方法从猪带绦虫成虫cDNA文库中筛选出了TsLDH-A的全长序列并预测得到其编码蛋白的结构与功能方面的信息,该基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达。