非洲猪瘟病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确、特异的非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)定量检测方法,根据TaqMan探针荧光定量分析原理,对ASFV核酸进行了实时荧光定量PCR分析.借助计算机软件辅助,对ASFV基因序列及检测引物和探针进行了优化筛选,利用pET-ASFVP72质粒作为参比模板对PCR反应的Mg2+、引物、探针浓度等参数进行了优化,其最佳浓度分别为4.5 mmol/L,400 nmol/L和500 nmol/L.同时,对灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评估,最低检出量为102个拷贝数的质粒,特异性为100%,CT(Cycle Threshold)值的变异系数CV小于5%.对送检的15份(是否感染ASFV不确定)猪肉样品进行检测,结果全为阴性.试验表明,所建立的实时荧光定量PCR检测方法能够快速、准确、特异、灵敏地对ASFV核酸进行定量分析,从而为非洲猪瘟的检测提供了一个新的、可靠的方法.

双重TaqMan荧光定量PCR在β-地中海贫血产前诊断中的应用

目的建立基因点突变双重TaqMan荧光定量PCR方法,实现β-地中海贫血(β-地贫)高风险胎儿产前基因诊断快速、准确。方法以每反应管检测一个位点的突变和野生型基因序列,建立β-地贫基因点突变双重TaqMan荧光定量PCR体系,检测β-地贫高风险胎儿绒毛标本6例、羊水标本32例,根据荧光PCR阳性扩增结果结合两荧光通道的Ct值差异分析受检标本的基因型,同时以常规RDB检测为对照,分析与评价检测结果。结果 6例胎儿绒毛标本中,RDB检测无法判断结果 1例,经该方法检测为野合纯合子;RDB检测误诊为CD41-42合并CD26双重杂合子1例,经该方法检测为CD41-42杂合子。32例胎儿羊水标本中,RDB检测无法判断的标本1例,经该方法检测为CD41-42杂合子。该3例标本经重新采集胎儿羊水标本复查,验证了定量检测结果的准确性。结论β基因点突变双重TaqMan荧光PCR定量检测方法,可实现β-地贫高风险胎儿的快速准确产前基因诊断,操作简单快速,结果准确可靠,是较为理想的β-地贫产前诊断方法。

实时荧光定量PCR快速检测对虾IHHNV载量方法的建立和应用

目的：建立一种快速、定量、特异、灵敏的PCR方法用于对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的早期诊断和疫情监测。方法：根据GenBank登录的IHHNV毒株序列，使用生物学软件进行序列比对，在IHHNV保守区序列设计特异性引物与Taqman探针。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间，提高特异性、灵敏度、重复性，并与普通PCR进行盲样测试的比对。结果：本法线性范围5×10^2～5×10^7拷贝／ml，检出限5×10^1拷贝／ml，灵敏度超过普通PCRl00倍，特异性高于普通PCR，重复性极好（S=0．035～0．39，CV=0．13％-1．05％），检测时间为普通PCR的1／5，现场盲样IHHNV检出阳性率高于普通PCR26．00％。结论：本研究建立Taqman实时荧光定量PCR用于对虾IH—HNV检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点。

实时RT-PCR检测二氢嘧啶脱氢酶mRNA的表达

目的 建立实时逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测二氢嘧啶脱氢酶mRNA的定量方法,并分别从 RNA水平与蛋白质水平检测二氢嘧啶脱氢酶在人体部分组织中的表达。方法 采用基于TaqMan探针技术的 实时RT PCR方法检测二氢嘧啶脱氢酶mRNA的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测其蛋白质表达水 平。结果 实时RT PCR检测二氢嘧啶脱氢酶的线性范围可达102～109拷贝数/μl,批内误差<5%。结论 这 一实时RT PCR的方法可以从纳克级的总RNA中检出二氢嘧啶脱氢酶的表达,并且ELISA结果与实时RT PCR 结果有较好的相关性。

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪瘟病毒(CSV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)现场快速鉴别检测方法,参照GenBank中CSV和PRRSV特异性基因序列,设计特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测CSV和PRRSV的一步法荧光RT-PCR方法,并验证了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,该方法检测CSV和PRRSV的灵敏度分别可达0.25和1.99 TCID_(50)/100μL,对猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法,可对CSV和PRRSV进行快速诊断,适合现场检测。

人IL-6 mRNA的实时定量检测法

目的:建立TaqMan-MGB技术实时定量检测人IL-6 mRNA的方法,并用于检测人外周血单个核细胞在牛膝多糖诱导下IL-6 mRNA的表达。方法:(1)抽取人外周静脉血,EDTA抗凝,用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,用Trizol裂解液提取总RNA,将总RNA逆转录为cDNA,PCR扩增IL-6后纯化PCR产物,与pMD 18-T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α。提取重组质粒DNA,作为实时荧光定量检测的标准品。建立TaqMan-MGB技术实时定量检测IL-6 mRNA的方法。(2)终浓度分别为0、100、200、400、800和1600mg/L的牛膝多糖作用于人外周血单个核细胞,定量检测IL-6 mRNA的表达。结果:(1)酶切分析、PCR扩增以及测序结果均证实IL-6 cDNA成功重组到pMD 18-T载体上。(2)TaqMan-MGB技术检测IL-6 mRNA线性范围广;灵敏度高;特异性好;重复性好。(3)牛膝多糖作用于人外周血单个核细胞后IL-6mRNA表达增高。结论:TaqMan-MGB技术能较为精确地定量IL-6 mRNA。

基于便携式荧光定量PCR仪的兔病毒性出血症病毒现场检测方法的建立及应用

为建立兔病毒性出血症病毒免疫荧光PCR检测方法,参照GenBank中兔病毒性出血症病毒基因组序列,设计特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了能检测兔病毒性出血症病毒的荧光PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测兔病毒性出血症病毒灵敏度可达1.38LD50·100μL-1,该法对兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌、兔沙门氏菌、兔水疱性口炎病毒(RVSTV)和兔轮状病毒(RRV)的检测结果均为阴性。试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法可对兔病毒性出血症进行现场快速鉴别诊断,为兔病毒性出血症的诊断及防控工作奠定了基础。

初发SLE患者Th1/Th2及IL-10、IL-18基因的表达

探讨初发狼疮病人Th1/Th2分布及其调控细胞因子、细胞因子受体基因表达的差异。运用三色荧光标记法流式细胞术检测 35例未经药物治疗初发狼疮病人T细胞亚群分布 ,并以 10例正常人作对照 ;同时运用ABI770 0TagManRealTime定量PCR法检测其中 38例病人和 2 8例正常人IL 10、IL 18及其受体、IL 10 /IL 18mRNA表达的差异。结果 :(1)初发狼疮病人Th1较正常人明显减低 (P <0 0 5 ) ,但Th1/Th2无显著性改变 ;(2 )与正常组相比 ,SLE组病人IL 10mRNA表达无显著性差异 ,但IL 10R表达明显升高 (P <0 0 5 ) ;SLE组病人IL 18mRNA及其受体表达较正常人明显降低 (P值均 <0 0 5 ) ;(3)面部红斑组病人Th1/Th2较正常组降低 (P均 <0 0 5 ) ,IL 10R较正常组显著增高 (P <0 0 5 ) ;(4)RNP阳性组病人IL 10、较正常组升高 (P均 <0 0 5 ) ,IL 18降低 ;(5 )关节炎组病人IL 18R较无关节炎病人显著降低。SLE是一种以Th1细胞下降 ,Th2细胞相对占优势的免疫介导的自身免疫性疾病 ,源于诱导向Th1细胞分化的IL 18及其受体减少和细胞因子间失衡所致。

骨髓增生疾病JAK2 V617F突变快速检测体系的建立

目的建立一种骨髓增生性疾病JAK2 V617F突变快速检测体系,并调查中国正常人群中JAK2 V617F突变发生率.方法根据JAK2基因V617F位点DNA参考序列,分别设计靶序列扩增特异性引物、突变和野生型特异性TagMan探针,建立并优化基于实时定量荧光PCR技术的检测体系并对体系的灵敏度、特异性,重复性进行评价.同时,采用大引物定点诱变和直接克隆技术,构建相应的阴阳性质粒DNA,以形成包含检测方法与质控品的完整应用体系.结果建立了骨髓增生性疾病JAK2 V617F突变快速检测体系,此体系与传统Sanger测序比较,灵敏度和特异性均为100%,批内变异系数为0.006.同时,对1000份正常样本进行检测,检出JAK2 V617F突变1例,人群携带率1‰.结论本研究建立的检测体系操作简单、快速准确,低成本高通量,可应用于常规临床检测.JAK2 V617F突变是一种罕见突变,但在骨髓增生性疾病患者中应作为首先检测位点.

2q33区基因多态性与Graves病发病风险的研究

目的 观察2q33区rs1024161（C./T）,rs231726（C/T）和rs10197319（G/A）位点基因多态性与Graves病发病及甲状腺自身抗体间的关系.方法 收集Graves病患者600例及686名正常对照者.采集病史,包括年龄、症状、甲状腺肿、突眼,测定甲状腺激素及甲状腺自身抗体[促甲状腺激素受体抗体（TRAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）].同时留取血标本,抽提DNA,用TagMan-MGB探针法进行基因分型.再分析不同基因型与甲状腺自身抗体（TRAb,TPOAb）的水平,及其与Graves病发病风险的关系.结果 Graves病患者rs1024161和rs231726的TT基因型频率（53.67％ vs.43.44％,P=0.003和46.67％ vs.38.05％,P=0.002）,rs10197319的GG基因型频率（60.17％vs.54.08％,P=0.028）均高于对照者.rs1024161（C/T）,rs231726（C/T）和rs10197319（G/A）位点基因多态性与性别、TRAb和TPOAb水平无明显相关性.结论 rs1024161,rs231726和rs10197319位点基因多态性与Graves病的发病相关,2q33为Graves病的易感区段.

基于便携式荧光定量PCR仪的鸡传染性贫血病毒检测方法的建立及应用

本研究参照Gen Bank中鸡传染性贫血病毒基因组序列,设计特异引物和TaqM an探针,通过优化反应条件,建立了能检测鸡传染性贫血病毒的荧光PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法检测鸡传染性贫血病毒灵敏度可达2.69TCID50/100μL,该法对禽呼肠孤病毒(AR V)、马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqM an荧光定量PCR检测方法可对鸡传染性贫血病毒进行快速鉴别诊断,为鸡传染性贫血的诊断及防控净化工作奠定了基础。

基于便携式荧光定量PCR仪的猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒现场检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒一步法荧光RT-PCR鉴别检测方法。本研究参照Gen Bank中猪流行性腹泻病毒以及传染性胃肠炎病毒特异性基因序列,设计特异引物和Taq Man探针,通过优化反应条件,建立了检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒的一步法荧光RT-PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒灵敏度分别可达0.32 TCID_(50)/100μL和1.58 TCID_(50)/100μL,该法对猪轮状病毒(RV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的Taq Man一步法荧光定量RT-PCR检测方法可对猪流行性腹泻和传染性胃肠炎进行快速诊断,适合现场检测,为猪病毒性腹泻的诊断和防控奠定了基础。

食品中金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR检测法

目的建立一种简单、快速、准确、特异性强的能定量检测金黄色葡萄球菌的方法。方法以金黄色葡萄球菌FomB基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,对金黄色葡萄球菌进行荧光定量检测。结果引物与Taqman探针比例为1∶4,镁离子为2.5mmol/L时本底最低,荧光信号最强;该法的灵敏度1.0×103拷贝,能特异区分金色葡萄球菌与其他葡萄球菌。结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应能够对金黄色葡萄球菌进行准确快速及定量检测。