厦门港纤小裸甲藻(Takayama pulchellum)的形态、生长及分子特征

在2003年厦门港发生的一次裸甲藻赤潮中分离得到了纤小裸甲藻(Takayamapulchellum),并对其形态学进行了光镜和电镜的观察,该株藻细胞个体较小,长约20～23μm,宽约14～20μm。藻细胞外表卵圆形,细胞上壳有一条明显的S形顶沟,顶沟是特异性的反S形。与模式种相比,这一株裸甲藻细胞核更靠上部,大部分细胞横沟都没有偏移。纤小裸甲藻在盐度为28时比生长率最大,达到0.42,随着盐度下降,比生长率也跟着下降,当盐度下降到16时,生长率为0。盐度范围在8～16时,超过80%的藻类能存活48h;当盐度低于4时,生长率和存活率都为0。24～27℃是纤小裸甲藻的最适生长温度,比生长率超过0.50,当温度升到30℃时,生长率急剧下降到约0.35。毒素测定结果显示该株裸甲藻不含麻痹性贝毒和神经性贝毒。本株纤小裸甲藻大亚基D1～D2区序列长度为721bp,与基因库中该种的一株相似种同源性超过99%。对18株裸甲藻转录间隔区(ITS)序列建立的系统进化树显示,纤小裸甲藻和Karlodiniummicrum的距离最近,通过ITS序列建立的系统发育树大致能够把Akashiwo属、Karenia属、Karlodinium属和Takayama属与Gymnodinium属区分开来。

Takayama pulchellum原位增长率测定的研究

现今用于测定有害藻华生物原位增长率的方法很难在现场进行有效地应用,因此我们尝试采用基于rRNA、叶绿素和总蛋白质浓度的定量测定方法来估算其细胞增长率。本研究重点对Takayama pulchellum细胞株(TPXM)的rRNA含量和特定生长率的关系进行了探索。用荧光标记的肽核酸探针结合全细胞杂交方法,结合流式细胞仪和专业图像分析软件对T.pulchellum单细胞水平的rRNA进行了定量检测。结果表明不同生长阶段的T.pulchellum单细胞rRNA水平与其相应的细胞特定生长率有较好的相关关系(R2=0.7293,p<0.01,n=14),单细胞蛋白质含量r、RNA水平与同步后的细胞周期变化情况也有较好的相关关系(R2=0.6984,p<0.01,n=14)。上述结果提示单细胞rRNA含量可作为指示细胞周期变化和细胞特定生长率的较好指标。

厦门西海域裸甲藻和原甲藻赤潮的观察

对近年来发生在厦门海域的裸甲藻(Gymnodinuum)和原甲藻(Prorocentrum)赤潮的发生情况进行了监测分析,采用了采样、分离、单种培养、显微镜和扫描电镜观察r、DNA序列分析等系列监测、分离培养和赤潮生物鉴定技术,重点观察并确证了厦门海域存在的赤潮原因种为微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、Takayama pulchellum、无纹环沟藻(Gyrodinium instriatum)。光学显微镜观察表明,赤潮发生海域存在着许多原甲藻和裸甲藻种类,但不能进一步确认到种。利用电子显微镜观察,可根据微小原甲藻体表规则的花纹等特征,根据Takayama pulchellum具有明显的特异性反S形顶沟等特征分别对它们进行有效地分类鉴定。分子分类学分析表明,T.pulchellum(株名为TPXM)28S rDNA D1-D2区序列长度为721 bp,与基因库中同种相似株的同源性大于99%;微小原甲藻(株名PMDH)的ITS和28S rDNA序列与基因库中同种序列的同源性高达99%;无纹环沟藻(株名GIXM)的ITS与基因库中登记的分离自中国深圳海域的4株同种藻的同源性也高达99%。用ITS序列和28S rDNA序列建立的系统进化树也能很好地显示微小原甲藻、Takayama pulchellum、无纹环沟藻之间以及它们与其他藻之间的亲缘关系。将上述结果结合文献记录和环境条件进行了分析,证实这3种赤潮种类Takayama pulchellum、无纹环沟藻、微小原甲藻是厦门海域较为常见的赤潮原因种。对上述检测和鉴定方法的系统应用也表明,这些方法可应用于对现场赤潮生物进行有效监测。

用扫描电镜观察裸甲藻的方法研究

将多聚甲醛固定的裸甲藻(Takayama pulchellum,TPXM)细胞采用离心法收集,进行小梯度的酒精结合离心法逐级脱水,临界点干燥并真空喷金后,能够在扫描电镜(SEM)下很好地显示出T.pulchellum细胞的完整形态和细微结构,如纵鞭毛、横沟、顶沟、顶突、带状物、藻体线纹、腰鞭毛等;同时环境扫描电镜(ESEM)也能对裸甲藻进行较好的形态学观察,但环境样品的ESEM和SEM电镜观察条件尚需要进一步完善.

基于DNA探针和FISH技术对两种有害浮游植物的检测研究

针对两种典型的有害浮游植物微小原甲藻和Takayama pulchellum(T.pulchellum)各设计了4条特异性探针,并采用基于PCR管载体的荧光原位杂交检测方法检测了这些探针的标记效果。实验结果表明,针对微小原甲藻和T.pulchellum核糖体大、小亚基DNA(LSU和SSU rDNA)的序列信息所设计的8条荧光标记探针均能够特异性地识别这些目标藻。各探针的标记效果有一定差异,经过标记的目标藻细胞在单种和自然水样混合样品中均可以通过荧光显微镜进行识别和区分。针对微小原甲藻和T.pulchellum的荧光原位杂交检测方法的建立将有助于对样品中这些目标藻进行快速准确地检测和监测。