Tamdy病毒糖蛋白基因的重组表达及抗体制备

原核表达Tamdy病毒(Tamdy virus,TAMV)糖蛋白Gn和Gc,分别制备兔抗融合蛋白Gn和Gc多克隆抗体。利用RT-PCR扩增Gn和Gc基因片段,分别构建原核表达质粒pET-28a-Gn和pET-32a-Gc,并在E.coli BL21(DE3)中诱导表达,镍柱亲和层析纯化融合蛋白Gn和Gc之后,以皮下注射方式分别免疫新西兰兔,制备兔抗融合蛋白Gn和Gc多克隆抗体。经Western Blotting和间接免疫荧光(IFA)鉴定多克隆抗体抗原识别能力,ELISA法测定抗体效价。结果显示,pET-28a-Gn、pET-32a-Gc原核表达质粒构建正确,融合蛋白Gn和Gc大小分别约为45 kD、74 kD,制备的兔抗融合蛋白Gn和Gc多克隆抗体能够分别识别原核表达的融合蛋白Gn和Gc和真核表达产物,效价分别为1∶409 600、1∶204 800。制备的多克隆抗体效价高,能够特异性识别原核系统和真核系统表达的TAMV糖蛋白,为TAMV的流行学分析提供基础。

基于塔姆德病毒NP蛋白间接ELISA方法的建立

目的原核表达和纯化Tamdy病毒(TAMV)核蛋白(NP),以此为抗原建立间接ELISA方法,以期用于TAMV感染血清流行病学调查。方法采用PCR法扩增NP基因,构建重组质粒(pET-32a-NP)并转化至E.coli BL21中诱导表达NP蛋白,15%SDS-PAGE鉴定和镍柱亲和层析纯化重组NP蛋白,以TAMV阳性羊血清为一抗,采用ELISA检测其抗原性。以纯化的pET-32a-rNP作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立检测TAMV血清抗体的间接ELSIA方法,评价其重复性、敏感性和特异性。检测采自新疆部分地区动物血清,采用建立的ELISA方法检测TAMV抗体。结果成功构建pET-32a-NP重组质粒和表达菌株pET-32a-rNP,重组蛋白大小约为72 ku并具有反应原性;ELISA优化试验确定的最佳包被浓度为4μg/ml、封闭液浓度为3%、血清稀释度为1∶100、血清孵育时间为100 min,酶标抗体稀释度为1∶3000,TMB显色时间为6 min;通过检测30份阴性样品确定临界值,当样品吸光充A450值≥0.268时判定为阳性;重复性试验结果表明,批内和批间变异系数(CV)<10%。敏感性试验表明,阳性血清稀释度达1∶600,具有良好的敏感性。特异性试验表明,该方法不与GTV、CCHFV和SFTSV发生交叉反应。取464份采自新疆不同地区的羊、狗和鼠血清标本进行ELISA检测,检出TAMV阳性血清68份,阳性率14.66%。结论建立的检测TAMV血清抗体的间接ELISA方法敏感、特异,且重复性良好,可用于TAMV的血清流行病学调查。