新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增环形泰勒虫Tams1基因,将扩增产物与pUcm-T载体连接,重组质粒经PCR和双酶切鉴定、测序确认后被亚克隆于pGEX-4T-2表达载体中。构建的表达重组质粒经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的Tams1基因片段长846bp,为一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与GenBank中的Tams1基因核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;系统进化树分析表明新疆分离株与印度株、毛利塔尼亚株和北非共和国株进化途径一致,与苏丹株、巴林株进化途径相差较远;推测的蛋白质抗原决定簇预测表明,Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇;表达的融合蛋白为56ku,能够被环形泰勒虫多克隆血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为进一步开展牛环形泰勒虫的分子生物学诊断、亚单位疫苗和核酸疫苗的研究奠定了可靠的基础。

基于环形泰勒虫Tams1基因多态性的二温式-PCR检测方法的建立

【目的】环形泰勒虫作为牛科动物重要的血液原虫对养牛业产生了重大危害。近年来针对该病原Tams1基因的诊断方法及候选疫苗筛选进行了大量工作。但研究证明该基因多态性对诊断及免疫效果存在影响。基于此,本研究对Tams1基因多态性特征进行了分析,并为该病的诊断建立一种实施有效的检测方法。【方法】参考GenBank中公布的环形泰勒虫Tams1基因的核苷酸序列,设计特异性引物。PCR扩增,获得了846 bp的核苷酸片段。将该基因片段与GenBank中主要的12种已知不同区域虫株的相应氨基酸序列进行比较分析。在保守区设计引物,以Tams1基因标准阳性质粒为模板建立环形泰勒虫病的二温式-PCR检测方法。经优化的方法用于田间样品的检测。【结果】该基因编码281个氨基酸,碱性氨基酸48个,酸性氨基酸42个,疏水性氨基酸100个。系统发生树结果显示,环形泰勒虫甘肃株与安哥拉、土耳其、巴林地方株亲缘关系较近。新疆株与意大利、西班牙地方株关系较近,而与甘肃株亲缘关系相对较远。这一结果通过环形泰勒虫不同国家地方株的氨基酸序列对齐结果可以得到进一步的说明。建立的二温式-PCR检测方法,可检测到0.31 fg.μL-1血液中感染虫体的量。特异性结果表明,仅有环形泰勒虫基因组DNA检测为阳性,其它对照虫种基因组模板均表现为阴性,且与感染牛的其它梨形虫无交叉反应。本实验建立的环形泰勒虫二温式-PCR方法对收集的335份野外样品进行检测,阳性检出率为16.33%,显微镜检测阳性率为2.25%,两者符合率100%。与普通PCR比较,二温式-PCR在敏感性方面没有显著差异,但其特异性更高,且该方法反复升温降温时间消耗短。【结论】环形泰勒虫Tams1基因不同地方株存在明显的差异。其氨基酸序列的多态性特征差异显著。因此该基因作为潜在候选抗原应注重多肽疫苗的设计。二温式-PCR方法具有的良好敏感性和特异性,对环形泰勒虫病的流行可以起到提前检测的效果,提高了疾病的诊断效率。

牛环形泰勒虫新疆株Tams1基因真核表达载体的构建及免疫反应性研究

研究采用PCR方法从焦虫病患牛的全血基因组中扩增得到846 bp的Tams1基因片段,将其克隆至真核表达载pcDNA3.1(+),构建Tams1基因的真核表达质粒。经测序验证后,将Tams1基因的真核表达质粒尾静脉注射小白鼠进行Tams1基因的瞬时表达。取接种小鼠的肝脏提取总RNA,采用RT-PCR扩增目的条带;用重组质粒pcDNA3.1(+)-Tams1皮下注射免疫小白鼠4次后,进行免疫抗体检测。试验结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)-Tams1含有完整的Tmas1基因片段。用该重组质粒免疫小鼠56 d后,小鼠血清中抗重组质粒pcDNA3.1(+)-Tams1的抗体效价可达1∶12 000以上,说明该重组质粒具有很强的抗原性。经Western-blot检验可得到抗原-抗体复合物产生的特异性条带,说明该重组质粒pcDNA3.1(+)-Tams1具有免疫原性。

泰勒焦虫表面抗原TaSP、spag-1和Tams1基因片段克隆与序列分析

为了解泰勒焦虫表面抗原基因特性,利用PCR方法对实验室保存的泰勒焦虫细胞表面抗原spag-1、Tams1和TaS部分基因片段进行克隆与序列分析。PCR结果显示所扩增的spag-1、Tams1和TaSP部分基因长度分别为372bp,324bp和321bp。系统发育树分析表明,与本次测序表面抗原TaSP和Tams1基因片段同源性最高的虫株登录号分别为FJ895154和AF214797的泰勒焦虫株,同源性分别高达100%与99.69%;与spag-1基因片段同源性最高的虫株登录号为X78188、XM949884和M63017,它们之间同源性为100%。

新疆和田地区于田县牛源环形泰勒虫种群基因型及遗传多样性分析

为探究新疆和田地区于田县牛源环形泰勒虫种群的基因型分布及遗传多样性,试验首先从该县10个乡镇(阿羌乡、喀尔克尔乡、科克亚乡、木尕拉镇、斯也克乡、先拜巴扎镇、英巴格乡、加依乡、奥依托格拉克乡、阿日希乡)采集疑似环形泰勒虫病患牛血液样本共443份,提取基因组DNA后对牛源环形泰勒虫Tams1基因进行PCR检测,统计10个乡镇牛源环形泰勒虫的阳性样本数及阳性率;然后在发现阳性样本的乡镇中,每个乡镇随机选取2个阳性样本进行测序,将测序结果进行同源性分析并与参考序列共同构建NJ系统发育树,分析基因型;最后对于田县环形泰勒虫种群进行遗传多样性分析。结果表明:在443份牛血液样本中,有93份样本环形泰勒虫检测结果为阳性,阳性率为20.99%;10个乡镇中有9个乡镇牛源环形泰勒虫检测结果为阳性,阳性率在10.45%~45.45%之间,其中阿羌乡阳性率最高,加依乡未检出。18株环形泰勒虫Tams1基因序列的核苷酸相似性为76.0%~100%,同乡镇的2个阳性样本之间的核苷酸相似性为91.0%~100%;这18株牛源环形泰勒虫在NJ系统发育树中未全部聚为一支,一些虫株甚至与其他国内外参考毒株表现出了更近的亲缘关系,但均为G1基因型。于田县G1基因型环形泰勒虫种群多态性位点数为119个,核苷酸多样性为0.053,平均核苷酸差异数为28.95个,单倍型数为12个,单倍型多样性为0.895,Tajima’s D值和Fu and Li’s F值均小于0。说明于田县G1基因型环形泰勒虫种群具有较高的遗传多样性且正在发生扩张。

环形泰勒虫Tams1单个B细胞抗体的制备及鉴定

本研究旨在利用单个B细胞抗体技术制备环形泰勒虫Tams1蛋白特异性单克隆抗体并对其反应性进行鉴定。构建重组质粒pET-30a-Tams1,并进行蛋白原核表达与纯化。纯化的Tams1蛋白免疫健康黄牛,第4次免疫后结合流式分选技术,从外周血单个核细胞获得分泌抗Tams1特异性单克隆抗体的B淋巴细胞(Ig M-/CD21+/抗原+B淋巴细胞)。经单细胞裂解及反转录后,通过巢式PCR扩增获得Ig G天然配对的轻/重链可变区域序列,并克隆至包含Ig G轻/重链恒定区域的真核表达载体。配对质粒共转染HEK-293T细胞后,收集细胞培养上清,Western-blot结果显示所得8株抗体均能与Tams1蛋白结合。同时IFA结果证明8株抗体可与裂殖子表面抗原Tams1特异性结合。上述结果表明,本研究成功获得8株Tams1特异性单克隆抗体,为后续该蛋白的功能研究及单个B细胞抗体制备技术平台的建立奠定了基础。

新疆牛环形泰勒虫虫病的流行病学调查

【目的】2006～2008年全疆14个地州的牛环形泰勒虫病流行病学调查。【方法】使用已建立的牛环形泰勒虫病间接ELISA检测方法,以纯化的重组蛋白GST-Tams1作为抗原。【结果】(1)牛环形泰勒虫病仍是新疆牛梨形病的主要病原。在2006年采集的278份牛血清样品中,阳性血清31份,感染率为11.15%。2007年,在532份牛血清样品中检出阳性血清61份,感染率为11.47%。在2008年的530份牛血清中检出阳性血清61份,感染率为11.51%。(2)2008年,在地方流行性疫病区牛环形泰勒虫感染率高达24%。【结论】新疆牛环形泰勒虫病的特点是疫区分布广,感染率居高不下,保持在11%以上,对动物和人类构成一定的威胁。这是新疆首次利用血清学方法对全疆牛环形泰勒虫病进行大规模的流行病学调查。

牛环形泰勒虫裂殖子/梨浆虫表面抗原基因非疏水区的克隆及GST-P27重组蛋白的高效表达

试验据GenBank登载的牛环形泰勒虫裂殖子/梨浆虫表面抗原(the merozoite/piroplasm surface antigen,Tams1)基因序列(登录号:AF214842),设计1对特异性引物,经PCR扩增出696bp的Tams1基因片段,将其插入pGEX-4T-2表达载体,提取质粒进行双酶切鉴定并测序,同源性达98%;将插入阳性质粒的BL21(DE3)菌种诱导表达重组蛋白,经优化后在37℃、0.5mmol/L IPTG诱导4h的表达条件下获得了表达量达1.39mg/mL的可溶性融合蛋白,大小为53ku;表达产物在Glutathione Sepharose 4B柱上纯化后,免疫印迹检测结果表明重组蛋白GST-P27具有良好的反应原性。

羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立羊环形泰勒虫单管套式PCR检测方法并初步应用于临床检测。根据GenBank上发表的环形泰勒虫Tams1基因序列,设计内、外2对特异性引物,进行单管套式PCR检测方法研究,并进行了特异性、敏感性试验及临床应用试验。结果表明:该检测方法能够扩增的基因片段大小为476bp,与GenBank收录的相关序列同源性高达93%～98%,而与附红细胞体、新孢子虫、艾美耳球、弓形虫RH株相关病原基因组均无交叉反应,能够检测出DNA的最小量为12fg。并对57份临床样品进行了检测,检测阳性率为40.4%,高于常规PCR和血涂片镜检测,表明该检测方法具有较高的敏感性,可用于羊环形泰勒虫感染的早期诊断,有较好的临床应用价值。

环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种快速、敏感检测牛环形泰勒虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛环形泰勒虫Tams1基因序列,设计合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测牛环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,该方法可以特异地检测牛环形泰勒虫,而对牛巴贝斯虫、反刍动物艾立希体和弓形虫检测均为阴性;该方法的灵敏度可达到180拷贝/μL,比常规PCR敏感10倍;组内和组间变异系数均小于1.0%。对15份临床血液样品和20只璃眼蜱进行检测,SYBR Green I荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为42.86%和28.57%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可准确、高效检测牛环形泰勒虫,为牛环形泰勒虫病防控提供技术支持。

新疆部分地区环形泰勒虫Tams1基因型及遗传多样性分析

为了对新疆部分地区环形泰勒虫Tams1基因型及遗传多样性进行分析,本研究对新疆托克逊、艾丁湖、青河和伊吾地区奶牛血液DNA进行检测,采用PCR方法对Tams1基因扩增、克隆和测序,并进行序列比对。通过MEGA、DNAsp、NetNGlyc等软件及在线软件分析Tams1基因及其蛋白序列。结果显示:(1)新疆地区23条环形泰勒虫序列除伊吾地区2号样品序列被归为G3型,其余均属于G1型;此外,新疆地区Tams1基因序列在核苷酸与氨基酸水平上分别具有90.1%~100%和83.9%~100%的相似性。(2)Tams1序列在核苷酸的168~217和479~528位置之间可检测到广泛序列变异。通过Hd=0.994±0.006、π=0.071±0.002、S=178、h=38及k=52.32均显示Tams1序列较高的遗传多样性;中性指数结果显示当地环形泰勒虫Tams1基因单倍型数大于多态位点个数,遗传多样性呈平衡选择。(3)Tams1蛋白的N末端显示出较大的序列变异性,在3个区域(氨基酸位置27~52、138~175和180~196)存在广泛变异。经B细胞抗原表位预测及3D结构同源建模,发现Tams1蛋白抗原位点多位于表面,其抗原性较好。综上,本研究发现本次备选采样点的环形泰勒虫具有较高的遗传多样性,该数据可为后续环形泰勒虫基因型和种群结构变化、不同致病特性及逃避宿主免疫机制等研究提供参考。

己内酰胺技术进展

DSM和壳牌开发Altam工艺DSM正与壳牌公司合作,将共同改进DSM从事多年的以C_4馏分为原料的'Altam'己内酰胺生产技术。壳牌将负责催化剂方面的研究开发,目前正在其设在阿姆斯特丹研究开发中心进行这方面的试验。DSM称,1～2年后将实现工业化生产。

牛环形泰勒虫诊断性靶基因片段的筛选及鉴定

通过对牛环形泰勒虫Tams1基因的不同片段进行克隆表达,以期得出该基因疏水区对蛋白表达的影响及筛选的目的蛋白作为ELISA抗原的特异性。利用3对不同的特异性引物对Tams1基因的三段区域(全长基因、无N端及C端疏水区、仅缺乏N端的疏水区)进行克隆,最终构建三种重组表达载体。经电泳分析筛选获得可溶性表达重组质粒,目的蛋白经亲和层析纯化后进行Western-blot分析。结果显示,在37℃条件下,经终浓度为1mmol/L IPTG诱导表达4h后,无疏水区的靶重组质粒表达出53ku的可溶性蛋白,其表达量达1.39mg/mL;而含全长基因或C端疏水区的质粒分别表达55ku、56ku的包涵体蛋白。Western-blot分析结果表明,筛选得到的可溶性蛋白能被环形泰勒虫阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。结果表明,该蛋白可作为潜在的进行牛环形泰勒虫病流行病学调查的候选抗原。