TapMan荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸方法的建立及意义

目的探究TapMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)快速检测乙型流感病毒核酸的方法及意义。方法 24例确诊感染乙型流感病毒的咽拭子及相关机构提供的甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒,均采用TapMan荧光定量RT-PCR检测,此外乙型流感病毒采用常规RT-PCR检测,观察检测结果。结果对于检测甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒,TapMan荧光定量RT-PCR仅对乙型流感病毒呈阳性,且反应与其他病毒无交叉。TapMan荧光定量RT-PCR相比于常规RT-PCR检测,对于不同浓度的乙型流感病毒敏感度更高。对24例送检样本,TapMan荧光定量RT-PCR的准确率为83.33%(20/24),明显高于常规RT-PCR检测的54.17%(13/24),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论对于乙型流感病毒的快速检测,根据病毒核酸的特点,使用TapMan荧光定量RT-PCR进行检测,具有高特异性、敏感度及准确率,推荐广泛应用。

B型禽偏肺病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立及应用

试验旨在开发一种特异性检测B亚型禽偏肺病毒(aMPV-B)的方法。研究参照GenBank中的aMPV-G基因序列设计一对特异性引物,建立aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法,优化该方法的反应条件,建立标准曲线,进行特异性、重复性和敏感性试验,并将该方法用于临床样品的检测。结果显示:建立的TaqMan荧光定量PCR方法只能检测出B亚型aMPV,其敏感性能达到1.34×10^(1) copies/µL,斜率为-3.346,截距为40.01,相关系数(R2)为1.00,循环阈值(Ct)与模板拷贝数之间呈现良好的相关性;临床样品检测结果显示,该方法检测出18份样品阳性,而普通PCR仅检测出10份阳性。综上所述,建立的aMPV-B TaqMan荧光定量PCR方法在样品检测中表现出良好的特异性和较高的敏感性,适用于临床样品的aMPV-B检测。

金铁锁β-actin基因克隆及其作为内参基因的研究

目的:建立金铁锁β-actin基因实时荧光定量PCR方法,为金铁锁实时荧光定量PCR的检测提供了内参基因。方法:根据Gen Bank上β-actin基因保守区域设计特异性引物,利用PCR扩增的方法扩增β-actin目的片段。并以β-actin作为内参基因,利用荧光定量PCR技术对糖基转移酶基因(UGT)在金铁锁根、茎、叶组织中的表达情况进行分析。结果:扩增到金铁锁的β-actin基因序列,长度为153 bp,与王不留行、鹅肠菜、马齿苋的β-actin有较高的同源性。而糖基转移酶基因在以β-actin作为内参基因时能够在金铁锁的不同组织稳定表达。结论:金铁锁β-actin基因是一个可靠的内参基因,适合在金铁锁三萜皂苷生物合成相关功能基因的表达研究中作为内参基因。

猪瘟野毒株与疫苗株双重TapMan实时定量PCR方法的建立与应用

为实现对猪瘟野毒株与疫苗株之间的快速鉴别,本试验建立了一种猪瘟野毒株与疫苗株的双重TapMan实时定量PCR的检测方法。通过对Gen Bank公布的猪瘟病毒野毒株及疫苗株的全基因组序列进行比对和分析,设计出2对特异性引物及2条TapMan探针,经反应体系及反应条件优化后,对其特异性、稳定性及敏感性进行了验证。结果显示,本方法能特异性地对猪瘟野毒株及疫苗株进行鉴别检测,并且不与其他常见的猪源病毒产生交叉反应,组内和组间检测变异系数均小于1%,敏感性较普通RT-PCR分别高出100倍和1 000倍以上,且野毒株与疫苗株的最低检测下限分别在1.3 copies/μL和1.58 copies/μL。应用本方法对实验室保存的甘肃某猪场猪瘟活疫苗免疫前、后的56份已知背景的样本进行检测,结果,阳性符合率高达100%。本方法特异性强,稳定性和灵敏度高,不仅能够准确定量,并且可快速地对同一个样品中猪瘟病毒野毒株、疫苗毒株进行检测,为后续猪瘟净化效果的评估提供了新的技术手段。