CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白胞内转导功能的检测

目的:观察融合蛋白CTP-HBcAg18-27-Tapasin在抗原提呈细胞内的转导功能。方法:体外分离培养近交系BALB/c小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4培养5d,再加入脂多糖诱导DC成熟。不同剂量的CTP-HBcAg18-27-Tapasin及RP-MI-1640培养液加入细胞培养介质中,激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光在细胞内的分布及定位,并对荧光强度进行定量分析,进一步以West-ern blot观察不同组细胞中Tapasin表达的差异来检测CTP-HBcAg18-27-Tapasin的转导效率。结果:成功体外诱导培养并鉴定小鼠骨髓源性树突状细胞,免疫荧光法证实CTP-HBcAg18-27-Tapasin能够穿透树突状细胞膜进入细胞质,而不能进入细胞核,且荧光强度50μg/L CTP-HB-cAg18-27-Tapasin组依次高于10μg/L CTP-HBcAg18-27-Tapasin组和空白组,Western blot也证实CTP-HBcAg18-27-Tapasin能够穿透细胞膜进入树突状细胞,结果显示差异有统计学意义。结论:CTP-HBcAg18-27-Tapasin具有穿透树突状细胞膜定位于胞浆的能力。

胞质转导肽-HBcAg_(18-27)-Tapasin诱导C57BL/6小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及HBV特异性CTL的表达

目的观察融合蛋白胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin诱导C57BL/6小鼠T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及HBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的表达。方法 C57BL/6小鼠随机分为实验组CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组CTP-HBcAg18-27、HBcAg18-27-Tapasin及空白组(生理盐水)。经肌肉免疫小鼠,ELISA检测T淋巴细胞分泌细胞因子;流式细胞术(FCM)检测T淋巴细胞内的细胞因子;CCK-8法检测T淋巴细胞增殖活性。结果实验组能有效刺激小鼠T细胞分泌Th1型细胞因子;FCM检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平明显高于其他组;且实验组T淋巴细胞增殖活性明显高于对照组及空白组。结论 CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫C57BL/6小鼠后,能提高T淋巴细胞增殖活性,能有效刺激T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及增加CTLs的表达。

CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin融合表达载体的构建及其表达和纯化

目的构建CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合基因表达质粒并分离、纯化融合蛋白。方法以质粒pCMV-SPORT6中Tapasin基因为模板,设计一对引物,上游引物带有融合基因CTP-HBcAg18-27序列,进行PCR反应;PCR产物回收纯化克隆到质粒pREST-B中,双酶切及测序鉴定;将鉴定正确的质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达;镍柱亲和层析法纯化融合蛋白;Western blotting鉴定融合蛋白。结果由质粒pCMV-SPORT6 PCR扩增得到1 480 bp大小的条带,为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合序列;将其克隆到表达质粒pREST-B后经酶切、测序结果正确;表达质粒转化DE3后成功表达,经纯化得到52.3 KD的蛋白;Western blotting鉴定为CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白。结论成功构建了CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合表达质粒,并成功表达,为进一步研究此融合蛋白的功能提供了实验基础。

分子伴侣Tapasin在介导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应中的作用

病毒及肿瘤细胞的清除很大程度上依赖于特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL),CTL通过T细胞受体(TCR)特异性识别病毒肽段并通过MHC-I类分子提呈引起感染细胞融解,经典MHC-I类分子在内质网内的装配要求有抗原肽配体和β2微球蛋白(β2m)的存在,而这一过程需要伴侣分子(chaperones)如Tapasin的参与。Tapasin是抗原递呈相关转运体(TAP)相关蛋白的基因产物,与MHC-I类分子同为免疫球蛋白超家族成员,在介导特异性CTL反应中有着重要作用,本文简述了Tapasin分子结构特征、在介导特异性CTL反应中的作用及与疾病的联系。

Tapasin对HLA-E细胞表面表达的影响

目的 :探索伴侣分子Tapasin对HLA E分子细胞表面表达的影响。方法 :体外构建HLA EcDNA的逆转录病毒表达载体 ,并通过感染的方法将其转入Tapasin阴性的T2细胞系 ,利用流式细胞术检测HLA E分子在靶细胞表面的表达情况。结果 :外源HLA E基因在Tapasin阴性的T2细胞表面获得表达 (74 13% ) ,而对照细胞及经空载体转染的T2细胞表面未检测到HLA E分子的表达。结论 :HLA E分子的细胞表面表达也存在TAP非依赖的方式。

重组表达泛素化HBcAg融合基因和Tapasin基因的慢病毒的包装及鉴定

目的构建和包装稳定表达泛素化HBcAg融合基因和Tapasin基因的重组慢病毒,为慢性乙型肝炎免疫治疗的实验研究奠定基础。方法设计引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因Ub-HBcAg,Ub-HBcAg基因与经酶切线性化的慢病毒表达载体质粒pLenti-CMV-HA-3Flag-P2A-EGFP定向连接,其产物pLenti-CMVUb-HBcAg-HA-3Flag-P2A-EGFP转化大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析。将化学合成的T2A-Tapasin基因插入至pLenti-CMV-Ub-HBcAg-HA-3Flag-P2A-EGFP,其产物p Lenti-CMV-Ub-HBcAg-HA-T2A-Tapasin-3Flag-P2A-EGFP经直接基因测序分析后与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒p LP/VSVG共转染人胚肾293T细胞,得到携带有Ub-HBcAg基因和Tapasin基因的重组慢病毒颗粒LV-Ub-HBcAg/Tapasin,重组慢病毒颗粒转染293T细胞,实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度,Western blot法检测目的基因的表达。结果成功构建和包装了表达泛素化HBcAg融合基因和Tapasin基因的重组慢病毒,实时荧光定量PCR证实重组慢病毒的滴度达3.25×10~8TU/mL。结论成功构建稳定表达泛素化HBcAg融合基因和Tapasin基因的重组慢病毒,为慢性乙肝的免疫治疗提供了实验基础。

CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin诱导C57BL/6小鼠HBV特异性CTL反应的机制

目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg_(18-27)-Tapasin通过介导JAK/STAT通路诱导近交系C57BL/6小鼠HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反应.方法:C57BL/6小鼠随机分为4组:CTPHBcAg_(18-27)-Tapasin实验组、CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin+AG490对照组、AG490对照组、PBS空白组.融合蛋白经肌肉注射免疫小鼠,腹腔注射AG490阻断JAK/STAT通路,CCK-8比色法检测T淋巴细胞增殖活性;流式细胞术检测T淋巴细胞内的的细胞因子;ELISA检测T淋巴细胞分泌细胞因子,Real-time PCR检测JAK/STAT通路信号分子表达水平.结果:CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin组相比CTPHBcAg_(18-27)-Tapasin+AG490组CD8^+IFN-γ^+T双阳性细胞百分比显著增加(P<0.01),淋巴细胞增殖活性差异具有显著性(P<0.01),Th1型细胞因子分泌水平显著增加(P<0.01),其他各组之间没有显著性差异,JAK/STAT信号通路信号中Jak2,STAT4 mRNA分子表达水平CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin组相比其他对照组表达水平差异具有显著性(P<0.05),CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin组Tyk2、STAT1mRNA的分子表达水平相比其他对照组表达水平具有显著性差异(P<0.01).结论:本研究表明CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin通过JAK/STAT信号通路促进Th1型细胞因子的分泌而促进特异性CTL反应.

胞质转导肽-HBcAg_(18-27)-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用

目的:观察融合蛋白胞质转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导HBV转基因小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟和对T淋巴细胞增殖的作用.方法:体外分离、培养HBV转基因小鼠及近交系C57BL/6小鼠髓源性DC,加入重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素(interleukin,IL)-4培养5d,再加入实验组10μg/mL CTP-HBcAg18-27-Tapasin、对照组10μg/mL CTP-HBcAg18-27、10μg/mL HBcAg18-27-Tapasin及空白组RPMI1640完全培养液.流式细胞术测定DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达,ELISA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测T淋巴细胞增殖反应,流式细胞仪检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子.结果:体外成功诱导小鼠髓源性DC;CTP-HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD83、MHC-1的表达;并且CTP-HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平及诱导DC增殖T淋巴细胞增殖能力明显高于对照组及空白组[IL-12p70转基因小鼠(F=205.85,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=406.20,P=0.000)];流式细胞仪检测实验组融合蛋白诱导的CTL水平也高于对照组[转基因小鼠(F=155.45,P=0.000);C57BL/6小鼠(F=392.90,P=0.000)],同时HBV转基因小鼠DC表面分子及在T淋巴细胞增殖中的作用要比C57BL/6小鼠低.结论:分子伴侣Tapasin修饰胞内化抗原肽能促进HBV转基因小鼠髓源性DC的分化、成熟,并能增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力及诱导CTL的产生.

胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin通过激活PI3K/Akt通路抑制HBV转基因小鼠特异性CTL凋亡

目的探讨胞质转导肽(CTP)-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白通过激活PI3K/Akt信号通路抑制HBV转基因小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T cell,CTL)凋亡。方法 HBV转基因小鼠随机分组,100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin、50μg CTPHBcAg18-27-Tapasin、50μg CTP-HBcAg18-27及生理盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次。流式细胞仪检测脾细胞中胞内细胞因子水平及细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR表达的变化。结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.74±0.20)%,高于对照组50μg CTP-HBcAg-18-27-Tapasin(2.42±0.53)%及50μg CTP-HBcAg18-27(1.70±0.56)%和空白组(0.66±0.71)%(F=741.45,P=0.000);同时,100μg CTPHBcAg18-27-Tapasin融合蛋白有效抑制特异性CTL凋亡(6.29±0.02)%,低于对照组50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin(7.72±0.15)%及50μg CTP-HBcAg18-27(26.30±1.13)%和空白组(58.26±0.23)%(F=5313,P=0.000),并伴随凋亡相关蛋白PI3K、P-Akt及P-mTOR上调(F=52.61、18.32和94.18,P<0.05)。结论 CTP-HBcAg18-27-Tapasin能有效诱导HBV转基因小鼠特异性CTL的表达,抑制其凋亡,机制与PI3K/Akt通路的激活有关。

过表达Tapasin树突状细胞来源外泌体诱导T细胞分化的实验研究

目的:探讨过表达Tapasin的小鼠骨髓树突状细胞(DCs)来源外泌体在诱导小鼠脾脏T淋巴细胞分化中的作用。方法:构建过表达Tapasin病毒转染至DCs,流式细胞术鉴定CD11c和GFP表达,超高速离心法分离DCs来源外泌体(Dexs)和转染上述病毒的DCs来源外泌体(Tap-Dexs),电镜、粒径分析和Western blot鉴定,并与T淋巴细胞共培养,CCK8法和ELISA法分别检测T淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ和IL-2水平。结果:与Dexs相比,Tap-Dexs能显著促进T淋巴细胞增殖、Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2分泌。结论:Tap-Dexs能促进小鼠脾脏T淋巴细胞增殖和诱导T细胞分化。

Tapasin和HLAⅠ类分子在人卵巢癌中的表达及相关性

[目的]通过检测tapasin和HLAⅠ类分子在人卵巢癌中的表达,分析两者相关性,进而探讨卵巢癌的机体免疫逃逸机制。[方法]采用免疫组化SP法检测了53例卵巢癌、例卵巢良性上皮瘤、例正常卵巢组织中的4030tapasin和HLAⅠ类分子的表达。[结果](1)卵巢癌中HLAⅠ类分子的表达显著低于良性上皮瘤及正常卵巢组织(P<0.001),且卵巢癌中的HLAⅠ类分子的表达水平与FIGO分期有关(P<0.05)。(2)tapasin在卵巢癌中呈现低表达,且其表达水平与卵巢癌中HLAⅠ类分子异常表达呈正相关(r=0.507,P<0.001)。[结论](1)人卵巢癌细胞低表达HLAⅠ类分子可能是卵巢癌机体免疫逃逸机制之一。()人卵巢癌低表达2HLAⅠ分子可能与tapasin低表达有关。

CTP-HBcAg_(18-27)-Tapasin联合佐剂CpG ODN免疫转基因小鼠的免疫应答研究

目的:观察以非甲基化寡聚脱氧核苷酸基序(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)为佐剂联合融合蛋白胞质转导肽(CTP)-HBc Ag18-27-Tapasin免疫乙型病毒性肝炎(hepatitis B virus,HBV)转基因小鼠的免疫反应。方法:HBV转基因小鼠随机分为5组,实验组:CTP-HBc Ag18-27-Tapasin+CpG ODN组,对照组:CTP-HBc Ag18-27-Tapasin,干扰素(IFN-α)组,CpG ODN组,空白组为生理盐水组。融合蛋白及CpG ODN经肌肉注射免疫小鼠,流式细胞仪检测病毒特异性T细胞反应(HBV-specific cytotoxic T cell,CTL)变化,全自动免疫分析仪检测血清乙肝表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag)水平,ELISA检测T淋巴细胞培养上清白介素(IL)-2、γ-干扰素(IFN-γ)水平,实时荧光定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测HBV DNA水平,免疫组化观察HBV转基因小鼠肝脏中HBs Ag水平。结果:CTP-HBc Ag18-27-Tapasin+CpG ODN组中IFN-γ+CD8+双阳性T细胞百分比增高,细胞培养上清IL-2、IFN-γ水平升高,肝脏病理显示炎性细胞增多,免疫组化显示HBs Ag表达水平明显下降,同时对血清HBs Ag及HBV DNA水平进行比较,CTP-HBc Ag18-27-Tapasin有明显抑制作用。结论:CpG-ODN作为佐剂可以增强融合蛋白CTP-HBc Ag18-27-Tapasin诱导的HBV转基因小鼠抗病毒免疫应答。

胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin体外诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用

目的观察融合蛋白胞质转导肽（CTP）-HBcAg18-27-Tapasin诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞（Dc）成熟和对T淋巴细胞增殖的作用。方法体外分离、培养近交系BALB／c小鼠髓源性DC，加入重组粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子和IL-4培养5d，再加入脂多糖诱导成熟。10,ug／LCTP—HBcAg18-27-Tapasin、50,ag／LCTP—HBcAg18-27-Tapasin、10p．g／LCTP-HBcAg18-27及RPMI-1640培养液加入培养介质。流式细胞术测定DC表面分子表达，EusA法测定DC培养上清液中的IL-12p70的水平，细胞计数试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应，流式细胞术检测增殖的T淋巴细胞内的细胞因子。多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。结果成功体外诱导小鼠髓源性DC；CTP—HBcAg18-27-Tapasin能明显上调DC表面分子CD80、CD86及主要组织相容性复合体-1分子的表达；509g／LCTP—HBcAg18-27-Tapasin组诱导DC分泌的IL-12p70水平为（61．12±10．25）pg／mL，依次高于10／xg／LCTP-HBcAg18-27-Tapasin组的（50．43±10．42）pg／mL、10〉g／LCTP-HBcAgl8m组的（40．17±8．54）pg／mL和空白组的（30．51±8．03）pg／mL（F=15．85，P=0．030和P=0．037）；CTP—HBcAg18-27-Tapasin诱导DC刺激T淋巴细胞增值能力明显高于对照组；流式细胞仪检测融合蛋白诱导的CTL水平50μg／LCTP-HBcAg18-27-Tapasin组为（2．05±0．41）％、10μg／LCTP-HBcAg18-27-Tapasin组为（1．06±0．10）％，高于10〉g／LCTP-HBcAg18-27组的（O．45±0．11）％和空白组的（O．09±0．02）％（F=60．22，P=0．003）。结论CTP-HBcAg18-27-Tapasin可以促进DC的分化、成熟，增强DC刺激T淋巴细胞增殖能力并能增加CTL的表达。

胞质转导肽-HBcAg18-27-Tapasin诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞抑制转基因小鼠HBV复制

目的 探讨经分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg18-27经CTP转导体内诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对HBV转基因小鼠病毒的抑制作用. 方法 20只HBV转基因小鼠随机分组,100 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin,50μg CTP-HBcAg18-27-Tapasi,50 μg CTP-HBcAg18-27及等渗盐水组经肌肉免疫小鼠,每周一次,共3次.流式细胞仪检测脾细胞中CTL水平,微粒子酶免疫分析法(MEIA)检测血清中HBsAg水平,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测HBVDNA水平,肝脏HE染色及免疫组织化学方法检测HBsAg表达.数据用均数±标准差((x-)±s)表示,用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用LSD法. 结果 100μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin融合蛋白免疫转基因小鼠后,能有效上调特异性CTL数量(2.70％±0.20％),其水平高于对照组50 μg CTP-HBcAg18-27-Tapasin (1.66％±0.53％)及50μg CTP-HBcAg18-27 (1.26％±0.56％)和空白组(0.75％±0.71％),F=741.45,P=0.000.肝脏HE染色及免疫组织化学结果显示实验组肝组织中炎性细胞的数量明显增多及HBsAg的表达显著减少,同时对小鼠血清中HBsAg及HBV DNA有明显的抑制作用. 结论 分子伴侣Tapasin修饰抗原肽HBcAg 18-27经CTP转导免疫HBV转基因小鼠后能增加特异性CTL数量,显著降低血清中HBsAg及HBV DNA水平,同时抑制肝脏中HBsAg的表达.

分子伴侣Tapasin在介导免疫反应中的作用

分子伴侣Tapasin是抗原提呈相关转运蛋白的基因产物，和MHC—Ⅰ同为免疫球蛋白超家族的成员，与MHC分子和多肽装配密切相关，是MHC—Ⅰ类分子与TAP之间的桥梁。Tapasin在抗原提呈过程中有着重要作用，因而了解其生物学特征、在介导免疫反应中的作用及与疾病的相关性具有重要意义。

Tapasin蛋白在肿瘤免疫治疗中的应用及前景

肿瘤免疫是目前恶性肿瘤研究的热点。Tapasin蛋白是一类位于内质网的伴侣分子,其在稳定肽组装复合体、招募主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子、编辑抗原肽等过程中发挥重要作用。研究表明,多种肿瘤细胞通过降低Tapasin蛋白表达影响抗原呈递,进而逃避免疫监视,主要调节途径包括干扰素(IFN)、核因子-κB(NF-κB)信号通路等。Tapasin蛋白与CD8;T细胞、树突状细胞等免疫细胞相互作用,介导肿瘤免疫的发生、发展。对Tapasin蛋白的结构与功能、在肿瘤细胞的表达与调控、与肿瘤免疫的关系等方面的研究进展进行综述,以期为肿瘤免疫治疗及中医药相关研究提供参考。