鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据鸭坦布苏病毒(DTMUV)BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法。特异性结果显示,DTMUV显示阳性,而3株非鸭坦布苏病毒均显示阴性,说明该方法具有高度特异性。其表达式为Ct=-3.32×lg Copy number+41.151,R2=0.998,R循环效率Eff%=100.072,DNA拷贝数在101～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品最低检测限为1.0×101拷贝/μL,变异系数低于5%。利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的蛋鸭的脾脏和肝脏组织进行检测,阳性率均为100%,而用本实验室建立的普通RT-PCR方法检测的阳性检测率为85%(17/20)和75%(15/20)。建立的方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点,可用DTMUV早期感染的快速诊断和流行病学调查。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。

鸡毒支原体 Taq Man实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测鸡毒支原体,根据鸡毒支原体的保守基因设计特异性引物和Taq Man探针,建立鸡毒支原体Taq Man实时荧光定量PCR方法并分析鸡毒支原体培养过程中颜色单位改变法(color change unit,CCU)和荧光定量PCR检测的相关性。结果显示,标准曲线y=-3.646x+44.208,相关系数R^(2)=0.998,最低检测限度为1 copy/μL;与其他菌株等均无交叉反应;组内和组间变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性。用建立的实时荧光定量PCR检测方法对26份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法检出率更高。建立的荧光定量PCR与CCU显示鸡毒支原体在对数生长期时,两者具有一定的对应关系。表明建立了鸡毒支原体Taq Man探针实时荧光定量PCR检测方法,可实现对鸡毒支原体的快速检测,为鸡毒支原体感染的防控提供技术基础。

猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒TaqMan二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S基因序列和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因序列,设计特异性的引物和探针。通过对引物和探针浓度等反应液用量以及反应条件等因素进行优化试验,建立了能同时鉴别检测TGEV和PEDV的二重荧光RT-PCR方法。用该方法同时检测其他病原如Po RV、PCV和CSFV时不发生交叉反应,特异性好;较普通PCR均高出3个数量级的敏感性,能够检测10 TGEV和10 PEDV拷贝数,敏感性高;组内重复和组间重复试验结果变异系数小,稳定性好;同时检测2个模板的不同浓度组合试验,干扰性小。本试验建立的二重荧光RT-PCR方法可用于TGEV和PEDV的鉴别检测,且具有特异、敏感、稳定、快速等优点,为进一步应用于TGEV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定了基础。

诺如病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的设计与优化

为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通过正交试验进行程序及试剂反应体系的优化,设计TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明该检测方法具有高灵敏度,最低检测限可达1.2 copies/μL,且在标准重组质粒浓度1.2×10^(5)~1.2×10^(0) copies/μL范围内具有较好的线性关系,其R^(2)=0.9907;该方法特异性强,在病毒的混合重组质粒样液中仅与NV病毒反应;组内和组间的重复性良好,变异系数(CV)值均小于2%;在数字PCR试验中进一步验证了该方法的可行性.本文设计的TaqMan荧光定量PCR检测方法可用于NV毒株的快速准确检测,有望成为NV诊断的有效工具.

犬瘟热病毒原液TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种不提取病毒RNA,直接采用Taq Man荧光定量RT-PCR检测样本上清液中犬瘟热病毒的方法。通过扩增CDV的NP基因部分片段构建重组质粒,建立Taq Man荧光定量PCR方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性、重复性检测;比较了提取核酸后进行荧光定量RT-PCR与不提取核酸对原液进行荧光定量RT-PCR检测的结果,最后对疑似CDV病料进行检测。结果显示,建立的CDV质粒Taq Man荧光定量PCR检测灵敏度比普通PCR灵敏度高1 000倍。将核酸提取液和病毒原液稀释后用该研究建立的方法进行检测,最小检测稀释倍数分别为10~7和10~5,表明提取核酸后样本中的有效c DNA浓度比直接使用病毒原液检测高100倍。特异性和重复性检测结果表明,该方法特异性良好且重复性较高。对97份临床病料进行检测,建立的方法共检出60份阳性,阳性检出率高于普通RT-PCR和胶体金快速检测试纸板,提取核酸法与原液法的一致率为100%。标准曲线分析表明,当病毒含量高于10~2拷贝·μL^(-1)时,与普通RT-PCR以及胶体金快速检测试纸板相比,CDV原液Taq Man荧光定量RT-PCR检测技术阳性检出率更高、准确性更好,值得临床推广应用。

番茄褐色皱果病毒Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)Taq Man荧光定量RT-PCR方法,本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和Taq Man探针,构建了标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估。结果显示,该方法特异性强,与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应。建立的标准曲线的R^(2)为0.999,扩增效率为102.096%,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当,是常规RT-PCR的100倍;采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品。建立的Taq Man荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测。

H9亚型禽流感病毒TaqMan MGB荧光RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank中发表的H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测H9亚型AIV的荧光RT-PCR方法,利用该方法和商品化试剂盒对临床样本同时进行检测。结果显示,该方法可特异性检测H9亚型AIV,与H3和H5亚型AIV、新城疫病毒、鸭病毒性肠炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合征病毒等主要禽病病毒无交叉反应;该方法检测范围为10-1~10-5个拷贝数,相关系数R2=0.997。对3个不同浓度的RNA进行组间和组内重复性试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于2.0%,具有良好的重复性。用本方法和商品化试剂盒对采集的349份野鸟粪便进行检测,两者具有高度的一致性(K=0.85),本研究建立的方法检测临床样本结果更接近真实值。本研究提供了一种快速、准确、敏感和特异的H9亚型AIV检测方法,可为临床诊断和流行病学调查提供可靠的检测依据。宁夏是中亚野鸟迁徙的主要旅居点,应加强野鸟和家禽群体的疫病监测,做到"早发现、早诊断、早处置"。

鸡贫血病毒Taq Man探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡贫血病毒(CAV)的基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品。通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%。实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳。

Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成引物和探针,优化反应条件,建立实时定量荧光PCR方法。实验结果表明,当50pmol/L的引物0.3μL和5pmol/L的探针0.5μL时,反应体系获得的CT值较小,而荧光强度增加值最大;制作的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系;可检测到相当于20拷贝/μL的病毒DNA;与猪细小病毒、圆环病毒和猪瘟病毒等不发生交叉反应;敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍。该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。

猪细小病毒4型Taq Man荧光定量PCR方法的建立与应用

根据GenBank中发表的猪细小病毒4型(PPV4)全基因组序列,针对其结构蛋白VP2基因的保守序列,设计合成特异性引物及Taq Man探针,以VP2克隆质粒为标准品,通过对探针浓度、引物浓度、dNTP浓度、镁离子浓度以及退火温度进行调整,建立了PPV4的Taq Man荧光定量PCR。反应条件优化后,该方法在6.73×109copies/μL^6.73×101copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.998;对PPV4的最低检测限为6.73×101copies/μL。特异性试验结果显示,用该方法检测其他基因型猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪圆环病毒2型等临床常见病毒,结果均为阴性。批内及批间变异系数均低于2%。用建立的荧光定量PCR方法和普通PCR方法对672份临床病料感染情况进行检测,阳性率为1.93%,而普通PCR检出率仅为1.63%。本研究首次报告在我国猪群中存在PPV4,同时建立的荧光定量方法为PPV4的检测、体外敏感细胞的筛选以及病毒器官嗜性的研究等提供了快速而敏感的分子检测技术。

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。

肺炎衣原体Taqman探针实时荧光定量PCR检测法

目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg^(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P>0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P>0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P>0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P>0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。

人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。

基于Taq Man探针的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL;用该方法对6份不同的组织样品进行重复性检测,结果显示具有良好的重复性和重现性。对阳性组织病料的检测表明该方法与常规RT-PCR阳性符合率为100%,但检测灵敏度高出常规RT-PCR 100倍。

鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法。方法针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性。对临床标本中的鼠痘病毒进行检测。结果研究结果显示,建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100%,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应。该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100—109拷贝),最低检测限度为4拷贝。该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3%。测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好。将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作快速诊断方法。结论本研究新建立的鼠痘病毒Taq Man MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用。

薄壳山核桃疮痂病菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

疮痂病是薄壳山核桃上最具毁灭性的病害,带菌植物材料是传播疮痂病的重要来源。准确、灵敏、快速的检测方法可为该病害流行规律调查和防控提供有力的依据。本文通过比较薄壳山核桃疮痂病菌Venturia effusa及其近似种之间的ITS序列差异,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了薄壳山核桃疮痂病菌的荧光定量PCR检测方法。特异性检测结果表明,该方法可以检测不同地区的薄壳山核桃疮痂病菌菌株,而对其近似种以及薄壳山核桃上的其他真菌均没有信号。本研究建立的检测方法对薄壳山核桃疮痂病菌DNA的最低检测限可达0.5 pg/μL。该方法用于田间样品检测时,检测时间仅需1 h,远快于常规的分离培养法。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法为薄壳山核桃疮痂病菌的快速检测和监测提供了有力工具。

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏、准确的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)分子检测方法,根据PDCoV M基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了PDCoV M基因Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.998;敏感性好,最低可检测到10 copies/μL的PDCoV M基因标准品;特异性试验结果显示,该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)及大肠埃希菌K88菌株均无交叉反应;重复性试验变异系数低于2%,表明重复性良好。对121份临床样本进行检测,阳性检出率为53.7%(65/121),随机选择10份阳性样品的扩增产物进行测序分析,进一步证实扩增产物中含有PDCoV。该方法具有敏感性高、特异性强、用时短和高通量等特点,适用于PDCoV的定量检测与分子流行病学调查,为PDCoV的准确定量及进一步研究奠定了基础。

虾虹彩病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测虾虹彩病毒(SIV)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,为实现虾虹彩病毒病(SIVD)快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段。【方法】根据SIV的MCP基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的片段克隆至pMD18-T载体制备重组质粒pMD18-T-MCPSIV;优化反应体系及扩增条件后建立检测SIV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,以pMD18-T-MCPSIV为标准品绘制标准曲线,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性。【结果】制备的重组质粒(pMD18-T-MCPSIV)DNA稳定性好,满足作为标准品的要求;标准品起始模板范围为2.0×101~2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR灵敏度高,对重组质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对虾组织SIV的检测灵敏度约10拷贝/mg,其临床检测的敏感性与套式PCR相当;与虾类其他常见病原无交叉反应,组内和组间变异系数分别为0.27%~0.54%和0.61%~0.95%,且扩增与产物分析同步完成,整个检测过程仅需1 h左右。采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床虾样品进行SIV检测,结果显示,两种方法的大部分检测结果一致,符合率为98.6%,但检测低拷贝数样品时前者具有更高的灵敏度。2018和2019年广西虾样品的SIV阳性检出率分别为19.7%和7.5%,且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾和红螯螯虾均检测到SIV阳性。【结论】基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品SIV检测,可为SIVD快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段。