基于新型高保真Taq酶的多重等位基因特异性PCR方法的建立与应用

在8号染色体存在部分替换片段的小鼠上挑选3个SNP位点进行初步方案检验,包括高保真Taq酶的特异性测试以及引物浓度对分型结果的影响,并评价该方法的灵敏度;之后应用该技术检测野生1号染色体替换系小鼠上的9个SNP的不同样本。对Taq酶的特异性研究表明:引物在未引入突变的前提下检测结果与测序结果保持一致;引物稀释实验说明浓度最低为0.003~0.006μmol/L,灵敏度的检测结果表示最低浓度检测限可达0.07 ng/μL以下。最后检测得到5种标准样本的基因型,其代表9个SNP的组合。成功验证并建立该新型高特异性Taq酶应用于多重等位基因特异性PCR实验的总体流程。提供一套具备高特异性、能够针对多个SNP位点进行检测的低成本方案,对多重等位基因特异性PCR技术的开发同样具有参考价值。

Taq酶对PCR定量检测结果的影响

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式,不通过活细胞,操作简便,在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107～108倍,大大提高了DNA的得率。在PCR反应过程中,Taq酶对PCR定量检测结果起到很大的影响。本文重点探讨Taq酶对PCR定量检测结果的影响。

利用Taq酶快速标记绵羊MHC区段BAC文库混合型探针

对限制性内切酶BseDⅠ酶切产物DNA 3′端进行32P末端补齐的Klenow大片段标记法进行改进,采用Taq酶进行快速标记,初步比较了两者探针制备和杂交的条件。探针纯化后放射自显影检测,结果显示酶切结果与软件分析一致,纯化后探针分布在0.3~2 kb之间,纯化回收效率较高。探针的分布合理,质量较高。采用阳性对照进行杂交证明改进方法简便可行。

常用化学试剂对Taq酶活性的影响

探讨用表面活性剂煮沸裂解结核杆菌（TB）快速提取DNA及在PCR试刑中加入一定浓度的表面活性剂和防腐剂后对Taq酶活性的影响程度．结果表明1％TritionX－100、1％Tween－20裂解TB后的残留部分对Taq酶活性无影响．我们用50ml1％TritionX－100或1％Tween－20与1ml临床标本混合后煮沸10分钟可有效裂解TB而获得阳性结果．但在PCR反应液中终浓度为1％TritionX－100、0．5％SDS、1％NP40、1％Tween－20、1／10000叠氮钠、1／1000甲醛对Taq酶有抑制作用，终浓度为5％甘油、1／10000硫柳汞、1／1000苯甲酸钠对Taq酶活性无影响．这对于分析PCR在出现假阴性及PCR试剂保存等方面都有一定意义．

再议科技期刊中Taq酶活性及其浓度单位的标注

Taq酶是生物技术领域中经常用到的检测指标,在学术论文中常有涉及。不同期刊对Taq酶单位的标注有差异,有些期刊将其活性单位标注为μmol/min,有些期刊将其活性单位与浓度单位均标注为U。通过查阅文献、有关标准和规定,笔者认为Taq酶活性单位应标准为μmol/min,而其浓度单位宜用μmol/μL·min表示。

不同DNA提取方法及Taq酶浓度对人白细胞抗原-B27基因分型结果的影响

目的探讨两种DNA提取方法(加热法、盐酸胍法)及不同浓度Taq酶对人白细胞抗原(HLA)-B27基因分型结果的影响。方法经柠檬酸右旋糖液抗凝的全血7人份,对比用加热法和盐酸胍法提取的DNA进行HLA-B27基因分型效果的差别;选取上述阴、阳性标本各1份,以Taq酶作浓度梯度试验,用浓度分别为每50微升0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、7.2U6个梯度进行对比试验,摸索出HLA-B27基因分型试验中所需的最佳Taq酶浓度。结果用盐酸胍法所提取的DNA在HLA-B27基因分型实验中能达到很好的效果,而加热法的内对照不清晰。Taq酶浓度在0.3U/50μL时条带不清晰,在7.2U/50μL时阴性标本易产生非特异性条带。结论盐酸胍法提取DNA优于加热法。不同实验室应根据自身条件确定最佳反应条件及Taq酶浓度。

杏SSR-PCR反应体系中Taq酶的初步优化

Taq酶的浓度是PCR反应的主要影响因素之一。本文随机选择大杏梅等5个杏品种,提取DNA,并经检测后用于SSR-PCR实验。在20μl的PCR反应体系中,Taq酶浓度设0.5U、1.0U和2.0U三个梯度,其它因素不变。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,当Taq酶浓度为0.5U时,有2个品种不能扩增出特异性条带;当Taq酶浓度为1.0U时,只有1个品种无扩增条带;当Taq酶浓度为2.0U时,所有品种均能扩增出条带,但同时会产生杂带。因此,在20μl杏SSR-PCR反应体系中,Taq酶浓度的适宜范围为1U-2U。

Taq酶浓度对HLA基因分型结果的影响

目的探讨Taq酶浓度对HLA基因分型结果的影响。方法对1例血液病患者血样用不同量的Taq酶进行HLA分型。结果加入Taq酶的量为4.5μl、10.5μl时,未出现特异性的结果,加入7.5μl时出现了特异性结果。结论不同量的酶结果差异很大,所以在酶的用量上,应当引起重视。不同实验室应根据自身条件,摸索最佳反应条件和Taq酶浓度。

Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化

Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量,以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生TaqDNA聚合酶含量的单因素:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量,结果表明:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度,对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响,而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺,响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为:IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值,最佳发酵工艺参数为:发酵温度37.2℃,pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L,在此条件下发酵,Taq DNA聚合酶比活力达到(43.822±0.878)kU/mg。

Taq DNA聚合酶及镁离子浓度对PCR扩增产率的影响

目前,聚合酶链反应(PCR)扩增技术被广泛运用,它具有特异性强、灵敏度高、诊断快速、结果稳定、操作简便等特点.为了使扩增获得最高产物率,本实验室分别以不同浓度的Mg2+、Taq酶做梯度实验,从中摸索出PCR扩增的最佳浓度.

Taq酶正斜体编排问题的探讨

针对国内科技期刊中Taq酶正斜体编排格式混乱的现状,笔者从Taq酶的名称来源及命名原则的角度,通过研读国际细菌命名法规的基础上,并参考国内外相关文献,建议Taq酶应斜体编排的规范。

自组装短肽K_2I_4K_2在PCR中提高Taq DNA聚合酶热稳定性

目的设计自组装短肽K_2I_4K_2作为新型表面活性剂来稳定Taq DNA聚合酶,探索其对Taq DNA聚合酶在高温下的半衰期以及对PCR扩增效率的影响,探讨其在PCR中应用的可行性。方法圆二色仪检测短肽K_2I_4K_2在不同理化条件下的二级结构;原子力显微镜检测其自组装形成的纳米结构特征;紫外可见光谱检测其对Taq酶在高温下半衰期的影响;普通PCR验证其在PCR中应用的可行性;RT-q PCR检测其对Taq酶扩增效率的影响。结果短肽K_2I_4K_2在盐离子溶液中能自组装形成纳米纤维结构,且在高温下拥有稳定的二级结构;短肽K_2I_4K_2使得Taq在95℃下的半衰期增加了约1.6倍;短肽K_2I_4K_2组装24 h后大大增加了Taq酶的扩增效率。结论短肽K_2I_4K_2较为显著地增加了Taq DNA聚合酶的热稳定性,能够很好地应用于PCR反应系统中。

TaqDNA聚合酶表达载体的构建及表达条件优化

Taq DNA聚合酶是基因工程中最重要的商业化工具酶之一,对于大量分子克隆的教学实验来说,存在一定的经济成本负担。一般基因工程实验室都有能力自主生产Taq酶,这样可以节省大量的科研经费,同时还可以培养学生综合实训能力。研究构建Taq DNA聚合酶表达载体,在大肠杆菌E.coli BL21(ED3)中表达,并成功提取Taq酶,检测其活性。PCR实验表明研究得到的Taq酶与商业化Taq酶的活力相当,为自主生产Taq DNA聚合酶教学实验室和研究实验室提供参考,极大降低实验室Taq酶的成本。

Taq DNA聚合酶5′~3′外切活性对荧光定量PCR的影响

目的为探讨Taq DNA聚合酶(后简称Taq酶)中5′~3′外切酶活性在Taqman探针法荧光定量PCR中的作用及影响,指导热启动Taq酶性能改造,本文研究了不同热启动Taq聚合酶的5′~3′DNA外切酶活性差异,以及该活性的高低对Taqman探针法荧光定量PCR的影响。方法使用荧光探针为底物,分别测定不同热启动Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性,对比在相同聚合酶活性下外切酶活性的差异,以及在荧光定量PCR扩增反应中的差异。结果在聚合酶活性相等的条件下,不同的热启动Taq聚合酶具有不同的5′~3′DNA外切酶活性,经化学修饰的Taq酶的5′~3′DNA外切酶活性分别下降2.7倍和4.55倍,经抗体修饰的Taq酶5′~3′DNA外切酶活性没有变化。在乙型肝炎病毒(HBV)DNA荧光定量PCR检测体系中,加入同等聚合酶活性单位的不同修饰方法制备热启动Taq酶,外切酶活性高的酶比活性低的酶ct值更低。结论在Taqman探针法荧光定量PCR反应中,Taq酶对探针的外切降解过程是反应的限速步骤,提高Taq酶5′~3′DNA外切酶活性有利于提高反应效率。

融合大肠杆菌素DNA结合域的Taq DNA聚合酶的性质表征

Taq DNA聚合酶发现自水生热栖菌(Thermus aquaticus),是一种同时具有逆转录酶活性以及DNA聚合酶活性的工具酶。Colicin E(简称CE)蛋白质是一类以维生素受体BtuB为跨膜受体的大肠杆菌素,其中CE2、CE7、CE8和CE9是非特异性的DNase型大肠杆菌素。Taq DNA聚合酶由5′→3′核酸外切酶结构域、3′→5′核酸外切酶结构域以及聚合酶结构域组成。缺失5′→3′核酸外切酶结构域的Taq DNA聚合酶(ΔTaq)具有更高的产量,但是其进行性很低,无法扩增长片段。为了提高ΔTaq的进行性,本研究融合dCE和ΔTaq,发现dCE-ΔTaq的进行性相比于Taq DNA聚合酶和dCE-Taq显著提升,并且其逆转录酶活性也比ΔTaq更高。dCE8-ΔTaq的提升最明显,不仅能够1 min内扩增8 kb的DNA片段,并且产量高于其他突变体。综上所述,本研究通过将ΔTaq DNA聚合酶和dCE进行融合,提升了Taq DNA聚合酶的PCR效率和逆转录活性,为改造Taq DNA聚合酶提供了新的方法,有望开发出性质更好的Taq DNA聚合酶。

单酶法RTP-CR检测马铃薯纺锤块茎类病毒

根据Taq酶既有聚合酶活性又有反转录酶活性的特点 ,探索了只在Taq酶单独作用下完成RT PCR反应的条件 ,以达到对马铃薯纺锤块茎类病毒 (PSTV)的快速检测。结果表明 ,反转录阶段退火温度在 37℃、循环数不少于 10次的情况下 ,PCR扩增能得到一条相关特异带。经过嵌合式PCR证明 ,这条带为PSTV的特异带。与其他检测方法相比 ,用单酶法RT PCR检测PSTV步骤简单 。

一种移码差错率大幅度下降的聚合酶N端缺失体的研究

采用双引物定点突变法，构建了以２３６位氨基酸为起始密码子的Ｔａｑ酶（ＴａｑＮＤ２３６）的高表达质粒。并以－１移码突变质粒ｐＦＤＰＭＩ１８作为模板，建立了测定ＤＮＡ聚合酶的体外合成精确性的Ｇａｐｐｅｄ－ＤＮＡ系统。通过转化大肠杆菌ＴＧ１菌株后计数Ｘ－ｇａｌ平板上蓝白菌落的比例，测定了Ｔａｑ和ＴａｑＮＤ２３６两种ＤＮＡ聚合酶在ＤＮＡ体外合成中的移码突变率，发现缺失后的ＴａｑＮＤ２３６复制精确性提高了１０倍以上。

CETP基因TaqⅠB位点多态性与高胆固醇血症的关系

目的探讨胆固醇酯转运蛋白CETP基因TaqⅠB位点多态性与汉族人群高胆固醇血症的关系。方法应用聚合酶链技术-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测汉族人群464例高胆固醇血症(高胆固醇血症组)、852例边缘高胆固醇血症(边缘高胆固醇血症组)及1 309例正常血脂(正常对照组)人群CETP基因内含子1的TaqⅠB位点多态性。结果按TaqⅠ酶切位点存在与否分为B1B1、B1B2、B2B2 3种基因型和B1、B2 2种等位基因。高胆固醇血症组较边缘高胆固醇血症组、正常对照组LDL-C、CETP升高,HDL-C降低(P<0.05)。CETP基因TaqⅠB多态性基因型及等位基因频率在3组人群中的分布差异有统计学意义,高胆固醇血症组和边缘高胆固醇血症组的B1B1基因型及B1等位基因频率显著高于正常对照组(P<0.05)。CETP基因TaqⅠB多态性B1B1基因型者血清TC、LDL-C和CETP水平明显高于B1B2基因型和B2B2基因型(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示CETP基因TaqⅠB B1B1基因型是高胆固醇血症的独立危险因素。结论胆固醇酯转运蛋白基因TaqIB位点存在基因多态性,B1B1基因型及B1等位基因与高胆固醇血症有着密切的关系,可能是汉族人群高胆固醇血症的原因之一。