TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测上述3种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法。该方法仅对BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因扩增呈阳性,而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌(A型、B型和D型)、多杀性巴氏杆菌(A型和B型)等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性;最低检出限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。利用本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法对29份临床样品进行检测,获得BVDV、BRV、BCoV的4种混合感染型,其中BVDV与BCoV的混合感染率最高(27.6%);与已有单重RT-qPCR方法比较,发现两种方法检测BVDV、BRV和BCoV的符合率分别为100%、96.5%、100%。结果表明,本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点,可为今后BVDV、BRV和BCoV共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。

一种可用于溶瘤病毒M1体内组织定量的TaqMan RT-qPCR检测法的建立与评价

目的:监测溶瘤病毒M1在组织中的传播情况,以更好地控制给药剂量,确保安全性。方法:建立一种基于TaqMan的实时定量PCR检测法,用于对组织中溶瘤病毒M1的检测和定量,并检测静脉注射病毒后多种实验动物体内的病毒载量和分布。结果:我们以一对特异的引物(Q3)和标准RNA开始SYBR Green RT-qPCR研究。通过优化实验方法发现当退火温度高于62℃时可降低基质效应,但却影响了扩增效率。因此我们建立了一步法TaqMan RT-qPCR实验,重新设计了一对Q3短引物(Q3S)。运用一步TaqMan RT-qPCR检测法和Q3S引物,在混有SD大鼠或食蟹猴基质RNA的背景下,均能特异性检测到低拷贝数的标准RNA。经验证,该方法适用于检测M1病毒在小鼠、SD大鼠和食蟹猴体内的组织分布。结论:利用Q3S引物构建的TaqMan一步法RT-qPCR能够定量检测不同动物不同组织样品中的M1病毒,具有特异性和敏感性,可进一步应用于临床样品的检测。

饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分三重TaqMan-MGB荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立饲料用鱼类、哺乳类及禽类源性成分的广谱、快速检测方法,收集Genbank中鳕鱼、鲈鱼、沙丁鱼等鱼类,猪、牛、羊等哺乳类以及鸡、鸭、鹅等禽类的18S rRNA基因序列,分别设计特异性扩增引物和MGB-TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和条件,每种引物探针体系均可以特异性检测目标物种类型而与其他物种无交叉反应。3套引物探针体系组合后可同时检测鱼类、哺乳类及禽类源性成分,三重荧光PCR方法的最低检测限可低至0.002 ng或0.02 ng基因组/反应,变异系数均小于2%。利用建立的三重荧光PCR方法检测35份进境及国产饲料样本,从2份进口饲料及1份国产饲料中检出非标定动物源性成分,结果与行业标准方法的检测结果一致,符合率100%。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR方法具有特异性、敏感性高、重复性好等优点,为包括饲料在内的动物产制品源性成分定性分析提供了新的技术分析手段。

番茄褪绿病毒TaqMan荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

【目的】本研究旨在建立TaqMan实时荧光定量PCR(TaqMan RT-qPCR)技术,快速检测单头烟粉虱Bemisia tabaci体内的番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,ToCV)。【方法】根据ToCV外壳蛋白保守序列设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了TaqMan RT-qPCR方法;与常规PCR检测进行比较,检测该方法的灵敏度与特异性;并应用该方法对单头烟粉虱成虫体内ToCV进行了快速检测。【结果】本研究构建的TaqMan RT-qPCR检测ToCV的标准曲线,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,扩增效率为98%。该方法对ToCV的最低检测浓度为8.3×10 copies/μL,灵敏度是常规RT-PCR的1000倍。该方法与田间番茄两种重要病毒番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)和番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)检测无交叉反应。单头烟粉虱成虫ToCV检测结果表明,温室内ToCV侵染植株上烟粉虱携毒率为100%,田间烟粉虱的携毒率为30%。【结论】本研究建立的TaqMan RT-qPCR检测方法,可快速有效检测单头烟粉虱体内ToCV携毒情况,为该病毒病的防控提供了技术支撑。

Establishment of a Real-time Fluorescent Quantita- tive RT-PCR Method for Pineapple mealybug wilt as. sociated virus-2

Pineapple mealybug wilt associated virus-2 （PMWaV-2） is an important pathogen causing Mealybug wilt of pineapple （MWP）. We established a realtime quantitative RT-PCR （RT-qPCR） method with TaqMan probe based on specific primers of conserved nucleotide sequence of PMWaV-2 coat protein gene. The results showed that the method was higldy sensitive to positive sample, but had no fluorescence signal to health sample and blank control. The sensitivity of RTqPCR was about 100 times higher than general PCR. Reproducibihty test revealed that the coefficients of variation between intra-and inter-assay were beth within 1.85%, indicating it was a quantitative detection method for PMWaV-2 with simple operation, strong specificity, high sensitivity, and reliable reproducibility.

三重荧光PCR检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7

目的建立一种检验沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7的TaqMan探针三重荧光PCR方法。方法针对沙门氏菌属特异性invA基因、金黄色葡萄球菌rpoB基因、大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因设计引物与探针,建立三重荧光PCR体系,对引物与探针浓度及退火温度优化,并进行特异性和敏感性研究。结果引物与探针的最优添加量为:invA 0.2μL、ropB 0.4μL、rfbE 0.5μL;最优退火温度为60℃。特异性试验显示16株非目标菌株扩增结果为阴性;目标菌株均出现显著扩增。敏感性试验显示,3种微生物对应的最低菌体数量检出量依次为:230、38、670 CFU。结论该方法特异性好、灵敏度高,能够快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7。

三重荧光定量PCR检测水产动物源细菌磺胺类耐药基因

根据Gen Bank中细菌磺胺类耐药基因Sul1、Sul2和Sul3的保守序列设计3对特异性引物及相应Taq Man探针,以重组质粒标准品为模板对反应条件进行优化,建立一种可同时检测上述3种耐药基因的三重荧光定量PCR方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重复性及临床菌株检测试验。结果表明:该方法定量范围为1×10~1~1×10~8拷贝/反应时,其标准曲线呈良好的线性关系;该方法灵敏度高(3个基因的最低质粒检测限均可达到10拷贝/反应)、特异性强(与其他病原菌及病毒无交叉反应)、重复性好(变异系数均小于2%);对临床菌株的检测结果与药敏试验结果的符合率达94.2%,且整个检测过程可在2 h内完成。所建立的可同时检测Sul1、Sul2和Sul3基因的三重荧光定量PCR方法可用于临床检测细菌的磺胺类耐药基因。

苜蓿花叶病毒RT-PCR和RT-qPCR检测技术体系的建立与应用

为准确检测侵染马铃薯核心种苗和种薯的苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus,AMV),以AMV马铃薯分离株为阳性材料,建立AMV RNA 1、RNA 2和RNA 3的反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和基于EvaGreen及TaqMan探针的反转录实时荧光定量PCR(reverse transcription real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)检测技术,比较3种方法的检测灵敏度,并测定不同马铃薯品种6种组织和桃蚜Myzus persicae、蓟马体内AMV RNA 1、RNA 2和RNA 3的含量。结果表明:建立的TaqMan探针RT-qPCR法对RNA 1和RNA 2的检测灵敏度分别为1.45×10^(1) copies/μL和1.46×10^(1) copies/μL,分别是EvaGreen RT-qPCR法和RT-PCR法的10倍;建立的TaqMan探针RT-qPCR法对RNA 3的检测灵敏度与EvaGreen RT-qPCR法相同,为1.15×10^(2) copies/μL,是RT-PCR法的10倍。丽薯15号6种组织中AMV RNA 1、RNA 2和RNA 3的含量为3.04×10^(6)~1.67×10^(8) copies/μL,以叶片中病毒平均含量最高;中薯21号6种组织中AMV RNA 1、RNA 2和RNA 3的含量为2.94×10^(2)~4.78×10^(8) copies/μL,未发现明显分布规律。蓟马体内AMV RNA 1、RNA 2和RNA 3的含量分别为8.64×10^(4)~4.76×10^(7)、2.13×10^(3)~1.50×10^(5)和8.08×10^(3)~4.96×10^(5) copies/μL,RNA 1的含量高于RNA 2和RNA 3。桃蚜体内AMV RNA 1、RNA 2和RNA 3的含量分别为4.71×10^(3)~3.44×10^(4)、2.22×10^(2)~1.32×10^(5)和5.41×10^(1)~8.08×10^(2) copies/μL,RNA 3的含量最低。表明RT-PCR法、TaqMan探针RT-qPCR法和EvaGreen RT-qPCR法均可有效扩增马铃薯6种组织和2种昆虫中的AMV。

基于TaqMan探针三重荧光PCR检测沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌

目的建立基于TaqMan探针三重荧光PCR检测沙门菌(salmonella,Sa)、肠炎沙门菌(salmonella enteritidis,SE)和鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium,ST)的方法。方法根据沙门菌aceA基因、肠炎沙门菌特异序列(GenBank:AF370707.1)、鼠伤寒沙门菌的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1),分别设计引物和TaqMan探针,在探针的5′端分别标记FAM、VIC、cy5,建立基于TaqMan探针三重实时荧光PCR检测沙门菌的方法。结果 29种不同血清型沙门菌均扩增出aceA基因,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的引物和探针分别特异性地扩增出15株肠炎沙门菌和11株鼠伤寒沙门菌,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性。aceA、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的三重荧光PCR扩增效率分别为89%、87%、90%,最低检测浓度分别达到280cfu/ml、260cfu/ml、300cfu/ml。结论本研究建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的特异性检测。

基于TaqMan探针三重荧光PCR检测MRSA

目的建立基于TaqMan探针三重荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)方法。方法根据nuc(GenBank:EF529607.1)、mecA(GenBank:JN108029.1)和femA gene(GenBank:DQ352463.1)基因序列,分别设计特异性引物和Taqman探针,nuc探针5、端标记TET、mecA探针5、端标记HEX、femA探针5、端标记FAM,建立基于Taqman探针三重荧光PCR检测MRSA的方法,并对69株金黄色葡萄球菌分离株进行基因检测与耐药表型比较。结果 MRSA出现femA、mecA、nuc基因扩增曲线,而表皮葡萄球菌等14株对照菌株扩增结果呈阴性;femA、mecA、nuc基因的扩增效率分别为104%、90.3%、98%,线性系数R2分别为0.999、0.994、0.998;69株分离株中femA、nuc基因阳性率为100%,mecA基因阳性率为13.04%,mecA与耐甲氧西林表型符合率为100%。结论建立的方法特异性强、准确,为金黄色葡萄球菌鉴定和耐药基因分析提供参考依据。