大洋臀纹粉蚧和南洋臀纹粉蚧TaqMan实时荧光PCR检测方法

臀纹粉蚧属有多个种类是重要的农业害虫,大洋臀纹粉蚧(Planococcus minor(Maskell))和南洋臀纹粉蚧(Planococcus lilacius Cockerell)是我国有重要检疫意义的有害生物。这两种臀纹粉蚧经常从进口泰国和东南亚水果口岸检疫中截获,但形态学方法很难进行准确鉴定。本研究首次利用mtDNA COI基因设计了两条特异性探针,应用TaqMan实时荧光PCR方法对大洋臀纹粉蚧和南洋臀纹粉蚧进行了快速准确鉴定。

基于gyrB序列Taqman实时荧光PCR检测在MTC鉴定中的应用

目的:初步分析基于gyrB序列的Taqman实时荧光PCR在MTC(结核分枝杆菌复合群)鉴定中的应用。方法:根据MTC gyrB序列设计引物和探针,应用荧光定量PCR对14株标准株及90株临床分离株进行临床研究,并与测序法结果进行比较。结果:14株标准株中,非洲分枝杆菌与结核分枝杆菌结果为阳性,其余结果为阴性;30株临床分离株与ITS测序比较,有1株NTM结果为阳性,1株MTC结果为阴性,其余菌株检测结果与测序结果符合,分析特异度高;将60株临床分离株的检测结果与测序结果进行比较,得到该方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均为100%。结论:采用基于gyrB序列的Taqman荧光PCR可快速检测和鉴别MTC和NTM。

中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法的建立

为给中华鲟提供及时而有效的保护,本研究根据NCBI上已公布的中华鲟D-loop基因序列设计并筛选了引物与探针组合,建立了中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法,并对所建立的实时荧光PCR方法进行方法学评价。结果显示,建立的方法能够对中华鲟及其产品进行快速而准确的检测,且特异性好,检测灵敏度高,能够达到0.001 ng的中华鲟DNA和100个拷贝的重组质粒DNA。该方法在应用于全国多个地区采集的鲟鱼样品的检测时,结果表明只有7个从相关科研单位得到的已经鉴定的中华鲟标本,经检测才是真正的中华鲟,而许多餐馆中号称的"中华鲟"经检测并非真正的中华鲟,只是其他的一些鲟鱼品种。因此本研究建立的中华鲟TaqMan实时荧光PCR检测方法特异性强、灵敏度高,且具有较好的应用价值。

NDM-1基因TaqMAN实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据NDM-1序列,设计并合成了PCR检测引物(ND-T-F和ND-T-R)和探针(ND-T-PROBE),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,TaqMAN实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。

基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法?第4部分:驴成分检测?实时荧光PCR法》合成引物和探针,利用Taq Man实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异性检测,然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工肉制品中检测方法的适用性。结果表明:本研究建立的方法特异性强,除驴肉外,牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑12种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL,灵敏度可达0.01%;方法的适用性较广,可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。

基于TaqMan实时荧光PCR技术检测转基因作物中的调控基因

为检测食品中的植物转基因成分,自主构建ppCaMV35S、ptNOS和ptCaMV35S 3种阳性质粒作为试验阳性对照,选用2种内源基因(pUbi、pRice-actin)和3种调控基因(pCaMV35S、tNOS和tCaMV35S),利用TaqMan实时荧光PCR技术对4种转基因作物(玉米、水稻、棉花、大豆)和2种非转基因作物(玉米、小麦)进行转基因成分检测。特异性检测结果表明,构建的阳性质粒能够满足实际检测需要,且内源基因和其他调控基因均具有较好的特异性。在转基因棉花试样中分别对调控基因pCaMV35S和tNOS进行检出限试验,检测结果显示,在转基因棉花试样中pCaMV35S和tNOS的检测限度分别为1、10 ng,能够对商业化或处于中间试验阶段的转基因作物及产品进行有效筛查检测。

TaqMan实时荧光PCR快速检测斑点叉尾鮰病毒

根据GenBank登录的斑点叉尾鮰病毒株ORF8基因序列,设计引物和Taqman荧光探针,建立了用于检测斑点叉尾鮰（Ictalurus Punctatus）病毒的实时荧光定量PCR方法;对实时荧光定量PCR反应条件进行了优化,评估了该方法的特异性、灵敏度和重复性,并建立了绝对定量方法。特异性试验证实,该方法只能检测到斑点叉尾鮰病毒,与真鲷虹彩病毒、蛙虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒等多种常见的水生动物病毒没有交叉反应,具有高度的特异性。标准曲线表明,在3.3×10~3.3×107拷贝数之间有较好的线性关系（r=0.998 3）,最少可检测到33个拷贝的阳性质粒,敏感度很高。同一样品于试验内及试验间的重复性试验发现,变异系数分别为0.7%和1.2%,重复性较好。该方法的检测时间从核酸抽提到出具结果仅需3h。试验结果表明,采用实时荧光PCR检测斑点叉尾鮰病毒方法具有特异性好、灵敏度高、检测耗时短的特点,并且能对病毒进行准确的定量分析,不仅适合口岸进出口检验检疫的需求,而且可以作为研究该病毒感染过程的有力工具。

鲤科疱疹病毒2型Taqman实时荧光PCR方法的建立

本研究针对鲤科疱疹病毒2型(CyHV-2)的主要衣壳蛋白基因,设计了特异性引物和Taqman探针,建立了实时荧光PCR方法。其检测下限为83拷贝,标准曲线R2>0.998,且经比对,灵敏度与现行方法相当。选取了健康异育银鲫、金鱼、鲤鱼以及常见4种水生DNA病毒以及7种水生环境细菌进行特异性实验,结果均无交叉反应。重复性实验显示,2份独立的15次重复结果变异系数均小于2%,说明本方法重复性好。本方法能作为目前CyHV-2疫病检测方法的有效补充,对该病的防控具有重要的意义。

利用Taqman实时荧光PCR检测市售肉制品中转基因大豆成分

采用优化的CTAB法提取肉制品中的大豆DNA,利用Taqman探针Real-time PCR检测转基因大豆成分的内外源基因。实验表明,利用优化的CTAB法提取肉制品中大豆基因组DNA,内源基因扩增良好;19种样品中有7种检测出CaMV 35S启动子基因,5种检测出RRS基因。首次揭示转基因大豆成分在中国市售肉制品中的存在,转基因大豆蛋白已进入下游肉制品加工链。

猪细小病毒7型Taqman实时荧光PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是近年新发现的一种细小病毒亚型。为建立PPV-7快速准确的检测方法,以PPV-7病毒全基因组为模板,设计合成1对引物和1条Taqman探针,建立了PPV-7Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本方法的标准曲线分析显示,其常数为0.999 2,敏感性可以达到46个病毒拷贝/μL,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。用猪圆环病毒2型、3型,猪细小病毒1型,猪伪狂犬病病毒等病原进行特异性试验,证实本方法不能从这些病毒中检测出特异性条带,表明本研究建立的PPV-7实时荧光PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点。用临床样品对该方法进行了应用性评价,从96份样品中检出52份PPV-7阳性样品,证实了本方法在生产实际应用的可行性。

TaqMan实时荧光PCR检测菰米成分的方法建立

本研究建立了一种能够快速检测食品中菰米成分的TaqMan实时荧光PCR方法。以菰米核糖体内转录间隔区(internal transcribed space, ITS)基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,建立菰米成分的实时荧光PCR检测方法,并进行物种特异性分析、灵敏度分析以及实际应用检测。结果显示:本研究所建立的实时荧光PCR检测方法特异性强,仅对菰米品种中国菰(Z. latifolia)、水生菰(Z. aquatica)、沼生菰(Z. palustris)和德克萨斯菰(Z. texana)基因组DNA出现特异性扩增曲线,供试的其他30种谷物以及异源性动植物基因组DNA均无扩增曲线;该方法对菰米成分检测的灵敏度为0.001 ng/μL菰米基因组DNA或0.01%(W/W)菰米粉。应用该方法对100份市售的进口菰米、菰米碎米、杂粮米及混合米粉等样品进行检测,在80份进口菰米和5份菰米碎米中检测出菰米成分,其他样品中未检出菰米成分,与商品标识一致。该方法灵敏度高,特异性强,可快速高效地进行菰米成分的真实性甄别。

TaqMan实时荧光PCR对沙门氏菌能力验证样品的快速检测与鉴定

本研究依据GB 4789.4-2016标准对沙门氏菌ACAS-PT526能力验证样品进行常规培养法检测,同时使用Taq Man实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术对预增菌培养物进行快速检测和鉴定。本研究首先以沙门氏菌特异性基因hut基因为靶基因,设计合成特异性引物和探针,提取各类食源性菌种的核酸DNA进行实时荧光PCR反应,仅沙门氏菌属出现阳性扩增,非沙门氏菌属、阴性对照和空白对照均无扩增信号,验证设计合成的引物探针具有较高的特异性。其次将能力验证样品和加标样品经预增菌、增菌、分离、纯化、生化试验和血清学鉴定,同时将预增菌培养物经实时荧光PCR测定后,18-D319和加标样品有显著的S型扩增曲线,Ct值分别为24.34和26.21,为沙门氏菌阳性,18-M906无显著荧光信号,Ct值>40.00,为沙门氏菌阴性。经API20E试剂条鉴定,18-D319为猪霍乱沙门菌亚利桑那亚种,鉴定百分率为99.90%,T值为0.97,18-M906为大肠埃希氏菌,鉴定百分率为99.80%,T值为0.94。实时荧光PCR检测结果与常规培养法检测结果一致,且更为简单快速,从预增菌到结果判定仅需12h,结果准确度高,一批次可检测多个样品,可用于大量样品中沙门氏菌的快速筛查和对能力验证样品的检测验证。

苹果壳色单隔孢溃疡病菌TaqMan实时荧光PCR检测方法

【目的】针对我国检疫性植物病原真菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌Botryosphaeria stevensii,建立实时荧光PCR检测方法。【方法】根据苹果壳色单隔孢溃疡病菌及其近似种的β微管蛋白基因(β-tubulin基因)保守序列设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,分别以病菌DNA和β-tubulin基因靶标序列重组质粒DNA为阳性标准品检验探针的特异性和灵敏度。【结果】探针BsP267对苹果壳色单隔孢溃疡病菌菌株表现出特异性阳性扩增,且与近缘种及其他常见的果腐病菌无交叉反应,扩增效率为105.858%,探针检测DNA的灵敏度达到1 fg/μL。【结论】本研究建立的苹果壳色单隔孢溃疡病菌实时荧光PCR检测法具有高特异性和灵敏度,可用于该病害的防控检测和检疫工作。

基于TaqMan实时荧光PCR的拟松材线虫分子鉴定技术

拟松材线虫与松材线虫的亲缘关系极为接近,是松材线虫病病原鉴定的主要干扰物种。为了排除松材线虫病病原鉴定过程中拟松材线虫的干扰,采用TaqMan实时荧光PCR技术,以核糖体DNA内转录间隔区(ITS)为模板设计拟松材线虫特异性引物和TaqMan探针,开展拟松材线虫分子检测和鉴定技术研究。结果表明:拟松材线虫ITS2区域存在较多的碱基差异,以此为模板设计的拟松材线虫引物和TaqMan探针组合具有较强的特异性;该组合灵敏性高,能够实现对拟松材线虫单条线虫甚至单个卵的分子检测和鉴定。结合现有的松材线虫分子鉴定技术,可以为进一步构建松材线虫双重检测技术体系奠定基础,为林业和海关检疫提供可靠的技术支撑。

双重TaqMan实时荧光PCR同时检测沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌方法的建立

以建立沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌双重Taq Man PCR方法为例,阐述Taq Man PCR方法建立的系统步骤和关键要素为目的,采用根据沙门氏菌Fim Y和单核细胞增生李斯特菌iap基因序列利用ABI primer express 3.0软件设计了物种特异性引物和Taq Man探针,采用标准曲线优化法对双重反应体系中引物和探针、Mg2+、d NTP浓度和Taq酶用量以及热循环条件等关键要素进行了优化,借助单双重PCR比较试验、多重PCR高低丰度模板抑制试验、灵敏度、特异性和重复性试验对建立的方法进行了验证进而得出了这样的结果:我们建立了涵盖设计要素、质控设置、体系优化、评价指标、验证试验共5个关键环节的双重Taq Man实时荧光PCR方法建立模式。建立的方法灵敏度高,沙门氏菌100CFU/ml,单增750CFU/ml;特异性强,对8种阳性菌株和37种近缘及远缘关系的阴性菌株成功鉴别的方法。本研究可借鉴应用于所有以核酸为检测对象的Taq Man PCR方法的建立模式。

贵州蓝莓蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

该研究利用TaqMan特异性探针实时荧光PCR检测手段,建立了高效、精准鉴别贵州特色(中蜂)蓝莓蜜的方法。对贵州白竹林、麻卡和乌卡坪三个地域的蓝莓种植区蓝莓蜜进行采集(包括意蜂蓝莓蜜),同时购买市售蜂蜜及加拿大蓝莓蜜,该方法通过采集贵州麻江县白竹林地区蓝莓种植园及蜂场周围蓝莓同花期26种植物样本,基于植物基因组中trnL基因序列的多序列比对,设计蓝莓trnL基因特异性引物,并进行TaqMan探针验证。结果表明,本研究设计的TaqMan探针特异性强,建立的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法能检测到蓝莓花粉DNA最低浓度为0.3 ng/μL;利用建立的方法对11种市售蜂蜜和贵州蓝莓蜜样本进行检测,发现贵州蓝莓蜜的Ct值为24~26,蓝莓花粉数在800~1700颗,其余蜂蜜Ct值在30以上,表明该方法能够有效实现贵州蓝莓蜜和其他蜂蜜的区分,具有良好的应用前景。

布鲁氏菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步评价

目的建立快速、准确检测布鲁氏菌感染的TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法利用布鲁氏菌IS711基因序列设计特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行评价。结果所建立的检测方法可对布鲁氏菌基因组进行特异性检测,对其他细菌无特异性扩增曲线。该检测方法基因拷贝数的检出限为3.8 copy/μL。批内变异系数在0.20%~2.01%,批间变异系数在0.71%~2.57%,具有较高的可重复性。采用qPCR检测临床标本,其灵敏度明显高于血培养检测,可对患者做出准确、及时的诊断。结论该实验建立的TaqMan qPCR检测方法能有效、快速准确地检测布鲁氏菌感染。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。

黑松露成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

以黑松露核糖体内转录间隔区基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立黑松露成分的TaqMan实时荧光PCR检测方法,并进行物种特异性验证。同时对不同掺入比例的模拟样品和市售黑松露及制品进行检测。结果表明:该方法特异性强,仅对黑松露基因组DNA出现特异性扩增曲线,与其它食用菌和异源性动植物样品无非目标扩增;检测灵敏度为1×10-3ng/μL黑松露基因组DNA或质量分数0.01%的黑松露粉。对120份市售黑松露(鲜品、冻品、干品、粉末)、黑松露制品(黑松露酱和黑松露调味粉)以及不含黑松露成分的杂菌包进行检测,在70份黑松露(鲜品、冻品、干品、粉末)和10份黑松露制品中检出黑松露成分,其它样品均未检出黑松露成分,检测结果与商品标识一致。该方法灵敏度高,特异性强,可快速精准地进行黑松露成分的真实性甄别。