Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。

实时荧光定量聚合酶链反应突触后密度蛋白93基因TaqMan探针的制备

目的:制备实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)突触后密度蛋白93(PSD93)基因TaqM an探针以进一步研究PSD93表达情况。方法:采用RT-PCR法,从生后1天的SD大鼠大脑组织mRNA中扩增PSD93基因部分CDS区片段,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定,采用TaqM an探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果:RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度113bp相符,DNA序列测序的结果与GenBank提供的已知序列(RNU50717)比较,所克隆的PSD93基因片段与其中的113bp完全相同,与PSD93基因100%同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0.99,反应效率为0.95,各点变异系数小于20%。结论:采用RT-PCR和T载体技术成功获得FQ-PCR PSD93基因TaqM an探针。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应方法的建立

以鲜切叶菜中的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)为研究对象,建立定量检测E.acetylicum的双重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法。以前期试验发掘到的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)的特异性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特异性基因oxi_50582462为检测靶点,对其设计特异性探针,并对反应体系进行优化,以12株E.acetylicum为阳性对照,以4株微小杆菌属内其他种的菌株以及10株非微小杆菌的腐败菌/致病菌作为阴性对照,对建立的RT-PCR进行特异性检测;通过标准曲线的制备、灵敏度、可重复性来评价该方法的有效性。最后,应用该RT-PCR方法对不同贮藏日期鲜切叶菜中的E.acetylicum进行检测。结果表明:本研究设计的探针特异性良好;检测靶点P401_RS0117025与oxi_50582462的标准曲线的R2值分别为0.994和0.999,且重复性好;该方法的DNA检测限为1.629×10^(-7)ng/μL,纯菌菌落检测限为3.4 CFU/m L,并能对鲜切叶菜中的E.acetylicum进行灵敏检测。此外,还建立了"Ct(阈值)-Nt(菌体浓度)"的数量关系,能对供试样品中的E.acetylicum进行绝对定量。总之,本研究建立了准确、灵敏、高效检测食品中腐败菌E.acetylicum的RT-PCR定量方法,为食品货架期预测提供了理论依据。

沙门氏致病菌标准阳性模板的构建及实时荧光定量聚合酶链式反应检测

目的:构建重组质粒作为标准阳性模板,建立食品中沙门氏致病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法。方法:以致病性沙门氏菌inv A基因上特异性片段为目标,设计并合成引物和Taq Man探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性。结果:构建出致病性沙门氏菌特异性基因片段的重组质粒,能够作为实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的标准阳性模板,标准曲线方程为Y=-3.151 lg X+42.86(R2=0.999),灵敏度80拷贝反应体系,能特异区分沙门氏菌与类型的细菌,同时,批内和批间的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。结论:本方法能够实现对食品中致病性沙门氏菌进行定性定量检测。

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。

实时荧光定量Taqman探针法检测线粒体DNA 1494C>T突变技术的建立及应用研究

目的建立以实时荧光定量Taqman探针技术检测线粒体DNA(mitochondial DNA,mtDNA)1494C>T突变的方法,实现快速、简便、准确筛查这一突变的目标。方法设计针对mtDNA1494C>T突变的TaqmanMGB探针和引物,从解放军总医院聋病分子诊断中心耳聋DNA库随机选取标本96份,遵循双盲法原则,分别以实时荧光定量Taqman MGB探针法和序列测定方法检测1494C>T突变,对检测方法进行可靠性验证。结果实时荧光定量Taqman MGB探针法检测mtDNA1494C>T突变,反应时间由原来的12小时缩短到1.5小时,96例耳聋病例中发现mtDNA1494C>T突变阳性患者11例,阴性85例,与直接测序法检测结果完全相符,未发现假阳性和假阴性。结论实时荧光定量Taqman探针技术检测mtDNA 1494C>T突变的方法简单省时,结果准确直观,特异性强,敏感性高,适用于对母系遗传性聋mtDNA1494C>T突变的大规模筛查或预防性检查。

白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测及抗真菌药物敏感性分析

目的:建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应方法,快速定量检定临床标本中的白色念珠菌并进行抗真菌药物敏感性分析。方法:针对白色念珠菌内转录间隔区和26S核糖体核糖核酸基因设计特异性引物和探针,构建含有上述基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,评价其特异性、灵敏度、重复性和稳定性。对1 185份临床标本中的白色念珠菌进行检测,同时进行真菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。对所有真菌分离株进行抗真菌药物敏感性试验。结果:研究结果显示,建立的白色念珠菌TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法专属性强,能准确检出白色念珠菌,而与其他念珠菌属真菌、非念珠菌属真菌、细菌、寄生虫和病毒均无交叉反应,特异性为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测白色念珠菌DNA线性范围达11个数量级,白色念珠菌最低检测限度为5个菌落形成单位。该方法重复性非常好,组内和组间相对标准偏差均小于2%。测试中相关系数、斜率和效率没有显著变化,表明该方法稳定性好,精密度高。将其成功应用于临床标本中白色念珠菌载量的定量检测,用普通PCR和基因克隆测序分析进行了确证。整个检测过程可在2 h内完成,可以用作定量分析快速诊断方法。应用TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应从1 185份临床标本中检出94份白色念珠菌阳性标本,真菌培养获得8株存活的白色念珠菌,抗真菌药物敏感性试验分析结果显示:这些白色念珠菌分离株对制霉菌素、咪康唑、克霉唑、益康唑、氟康唑、沃尔康唑均敏感,但对两性霉素B、酮康唑、特比萘芬、氟胞嘧啶已经产生了耐药性。结论:本研究新开发评价的TaqMan-小沟结合物探针实时荧光定量聚合酶链式反应,可以快速简易,精准稳定,特异灵敏地定量检定白色念珠菌,适用于动物源性产品中白色念珠菌检测、食品药品生物制品医疗器械安全检查、环境监测、流行病学调查。

实时荧光定量PCR结合探针检测MP的临床价值及MP耐药情况分析

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)结合探针检测对肺炎支原体(MP)的诊断价值,并分析MP的耐药突变情况,指导MP感染患儿的临床用药。方法选取2017年9月-2019年8月奉城医院收治并经诊断确诊的70例MP感染患儿及30例非MP感染患儿,对所有患儿咽拭子标本进行MP-DNA扩增,采用荧光探针法对MP与大环内酯类抗菌药物耐药突变率进行检测。收集所有患儿临床资料,并分析其与MP-DNA阳性检出及MP耐药突变的相关性。结果实时荧光定量PCR结合探针检测MP的敏感性和特异性分别为80.0%(56/70)和96.7%(29/30);双份血清MP-IgM抗体滴度呈4倍或4倍以上(升高或降低)变化组MP-DNA阳性检出率明显较单份血清滴度≥1∶160组高;患儿性别、年龄、入院时病程及入院前大环内酯类抗菌药物治疗史对于MP-DNA阳性的检出率均无显著影响;MP-DNA耐药突变率高达85.7%,入院前规律完成大环内酯类抗菌药物1个疗程组DNA耐药突变率为90.5%,明显高于未完成1个疗程组(80.0%)和未服用组(50.0%)。结论实时荧光定量PCR结合探针可作为检测MP的一种有效方法,为临床对MP感染患儿抗菌药物的使用提供依据,具有较高的临床应用价值。

TaqMan荧光探针技术检测不同血清型B群链球菌的方法建立及评价

目的建立基于TaqMan荧光探针技术,对不同血清型B群链球菌(GBS)鉴定的分子方法,为后续研究多重荧光探针技术检测不同血清型GBS奠定基础。方法根据不同血清型荚膜多糖(CPS)序列的差异设计引物和探针,用实时荧光定量PCR扩增CPS序列,建立不同血清型的GBS分型方法,从灵敏度、特异度及临床分离株检测等方面对该方法进行评价,并与胶乳凝集试验结果比较。结果同一血清型GBS的DNA的对数浓度与循环阈值(Ct)呈良好的线性相关,该方法的检测下限均为1pg/μL,一种探针只能检测对应血清型的GBS。10株标准菌株的TaqMan荧光探针技术检测结果与胶乳凝集试验结果一致。结论 TaqMan荧光探针技术是一种简单、快速、具有较高灵敏度和特异度的检测GBS血清型的方法,对临床分离株的分型优于乳胶凝集试验。

TaqMan实时荧光定量PCR快速检测淋病奈瑟菌ParC基因Ser87/Arg点突变

目的建立TaqMan实时荧光定量PCR快速检测淋病奈瑟菌ParC基因Ser87/Arg点突变的方法。方法设计引物与探针,优化PCR反应体系及条件,配制阳性标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果建立的TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线相关系数r为-0.9996(r_2=0.9993),特异度和敏感度分别为100%,94.6%。结论本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法,简便快捷,定量准确,可用于临床标本中淋病奈瑟菌ParC基因点突变检测,从而快速筛出氟喹诺酮高水平耐药株。

柯萨奇病毒A组6型TaqMan一步法实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立一种灵敏、特异的一步法实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR),用于快速、准确地检测柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)。方法利用MEGA7.0软件比对GenBank数据库中15条CV-A6 VP1序列,选择高保守区域设计特异性引物和探针;以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立检测CV-A6病毒的RT-qPCR方法;对该方法的灵敏度、特异度、重复性进行评估;并利用该方法对CV-A6病毒感染后的乳鼠组织进行病毒载量的检测。结果该方法在102~1011 copy/μL模板范围内出现良好的扩增曲线,检测极限约为102 copy/μL,标准曲线中R2系数为0.999,扩增效率为109.6%;且该方法对肠道病毒71型(EV-A71)、柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)和柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)均无交叉反应;另外,该方法在组间重复试验中,变异系数(CV)值小于2.0%。结论本实验建立的方法具有较强的灵敏度、特异度和重复性,可用于CV-A6病毒的日常检测、实验室诊断和定量分析。

TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量一聚合酶链反应（real-timePCR）快速检测方法，为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan—MGB探针，建立并优化real—timePCtt检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价，并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果本研究建立的TaqMan—MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0．2cfu，比普通TaqManreal—timePCR检测限（3—5cfu）提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（R^2=0．999）。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体，结果均为阴性，特异度为100％。结论TaqMan—MGB探针real—timePCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体，有很好的应用前景与价值。

实时荧光定量PCR快速诊断肺炎链球菌

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR),用于肺炎链球菌检测和流行病学调查。方法以肺炎链球菌自溶素(lyt)和溶血素(ply)的基因为目的序列分别设计引物和探针,将其分别与10株肺炎链球菌、13株非肺炎链球菌DNA以及不同浓度梯度的肺炎链球菌DNA进行荧光定量PCR,并将引物和探针应用于200例临床标本检测,同时通过传统的微生物培养鉴定的方法来验证荧光定量PCR的特异性和敏感性。结果 10株肺炎链球菌均获得了明显的扩增产物,13株非肺炎链球菌DNA无明显的扩增信号,其检测敏感性可达100 fg;200例临床标本,实时荧光定量PCR检测出42例肺炎链球菌阳性(阳性率为21%),而培养法阳性16例(阳性率为8%)。结论实时荧光定量PCR是一种敏感、特异、快速的检测肺炎链球菌方法,可用于肺炎链球菌的诊断和流行病学调查。

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测西尼罗病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应（TaqMan—based Real—timePCR）用于西尼罗病毒（WNV）核酸检测，为WNV的感染诊断和流行病学监测奠定技术基础。方法根据文献公开发表的WNV核酸检测引物和TaqMan探针，优选最佳引物探针。应用DNAWorks2．4在线软件设计8条寡核苷酸片段，基于PCR合成包含引物探针扩增区域的230个核苷酸作为WNV模拟核酸。并对TaqMan-based Real—timePCR条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度。结果该方法对WNV核酸检测有高度特异性，与流行性乙型脑炎、登革热1～4型等虫媒病毒均无交叉反应，对构建的DNA检测灵敏度达100拷贝／反应。结论TaqMan—based Real—timePCR是一种快速检测WNV特异、敏感的方法，适用于WNV的早期感染诊断和流行病学监测。

猪细小病毒7型Taqman实时荧光PCR检测方法的建立与应用

猪细小病毒7型(Porcine parvovirus 7,PPV-7)是近年新发现的一种细小病毒亚型。为建立PPV-7快速准确的检测方法,以PPV-7病毒全基因组为模板,设计合成1对引物和1条Taqman探针,建立了PPV-7Taqman实时荧光定量PCR检测方法。本方法的标准曲线分析显示,其常数为0.999 2,敏感性可以达到46个病毒拷贝/μL,批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。用猪圆环病毒2型、3型,猪细小病毒1型,猪伪狂犬病病毒等病原进行特异性试验,证实本方法不能从这些病毒中检测出特异性条带,表明本研究建立的PPV-7实时荧光PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点。用临床样品对该方法进行了应用性评价,从96份样品中检出52份PPV-7阳性样品,证实了本方法在生产实际应用的可行性。

弗氏枸橼酸杆菌TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应检测方法的建立

目的建立针对弗氏枸橼酸杆菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real time-PCR)检测方法。方法针对弗氏枸橼酸杆菌的特有序列设计引物和TaqMan探针,扩增目的基因建立标准曲线,确定检测方法的灵敏度;对20种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌进行检测,评价该检测方法的特异性;使用牛奶模拟标本评价方法在实际检测工作中应用性。结果 TaqMan real time-PCR检测方法对弗氏枸橼酸杆菌重组质粒的检测灵敏度为1.0×101拷贝/反应体系;该检测方法在检测30种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现特异性扩增。该检测方法对牛奶模拟样本中弗氏枸橼酸杆菌检测下限为1.0×102cfu/ml的菌量;通过对1.0×107、1.0×105和1.0×103三个浓度质粒标准品的重复检测,确定本方法的组内变异系数为1.90%～3.91%;组间变异系数为1.52%～1.69%。结论本研究建立的TaqMan real time-PCR检测方法可作为检测弗氏枸橼酸杆菌灵敏、特异、快速的方法。

实时荧光定量PCR检测人胰岛素样生长因子及其受体基因的方法学构建

目的建立检测人胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）、IGF-1受体（IGF-1R）、胰岛素样生长因子2（IGF-2）及IGF-2受体（IGF-2R）基因的实时荧光定量PCR。方法设计并合成检测上述4种基因的引物及TaqMan探针;提取胎盘组织RNA并逆转录为cDNA,分别将扩增的4种基因片段纯化后与质粒载体连接,克隆构建含目的基因片段的重组质粒,分别作为定量检测上述4种基因的标准品;用建立的实时荧光定量PCR检测上述4种基因,并用测序验证。结果 PCR扩增产物经测序分析证实分别为上述4种基因的特异性片段;定量检测IGF-1、IGF-1R、IGF-2及IGF-2R的线性范围分别为1.00×10^2-1.00×10^8copies/μL、2.00×10^2-2.00×10^8copies/μL、3.00×10^2-3.00×10^8copies/μL及5.00×10^2-5.00×10^8copies/μL;相关系数（r）分别为0.994、0.993、0.995及0.996;扩增效率分别为92.35%、96.06%、94.92%及98.84%;批间变异系数（CV）分别为1.64%-2.83%、1.73%-1.98%、2.47%-4.09%及2.25%-2.52%;批内CV分别为1.36%、1.02%、1.04%及0.96%。结论建立了高度敏感、特异检测人IGF及其受体的实时荧光定量PCR法。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白-2γmRNA表达水平

目的 建立TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法检测新型趋化因子巨噬细胞炎症蛋白 2γ(MIP 2γ)mRNA表达水平 ,并对方法进行评估。方法 TaqMan实时荧光定量RT PCR检测MIP 2γmRNA的表达。结果 线性检测范围达 6个数量级 ,最低检测下限为 6× 10 2 拷贝 ,最高检测上限为 6× 10 7拷贝 ,批间及批内变异 <12 2 %。正常Balb/c小鼠心脏、肝脏、肾脏组织均可检测到MIP 2γmRNA表达 ,以心脏表达水平最高。结论 采用TaqMan实时荧光定量RT PCR检测MIP 2γmRNA表达水平准确、特异、灵敏、快速、操作简便 ,具有临床推广价值。