尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立

尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。

TaqMan探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的:在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法:选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果:支原体PCR产物大小约为288bp,质粒质量浓度为13.9mg·mL-1,A260/A280(Ratio)为1.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝.μL-1。10μmol.L-1的引物浓度和10μmol.L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式:Ct=-2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论:支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。

TaqMan探针荧光定量PCR检测花生油中掺入棕榈油的研究

根据棕榈内源基因MT3-B设计引物和TaqMan探针，采用基因重组技术构建用于检测棕榈基因MT3-B的重组质粒作为绝对定量标准品，建立标准曲线，对花生油中掺入棕桐油1％～40％梯度混合油品提取DNA进行棕榈成分定量检测。结果表明，重组质粒标准品荧光定量标准曲线对数线性回归分析相关系数（R2）为0．996；花生油中掺入棕榈油达到5％时，可检出每亳升混合油品中棕榈MT3-B基因17．431copies，检测的重复性和特异性好。

TaqMan探针荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素D

建立了检测乳中产肠毒素D的金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法,以SED基因为肠毒素D的检测靶序列,设计荧光定量PCR引物和Taq Man探针,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了对产肠毒素D金黄色葡萄球菌快速检测的Taq Man探针荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,Taq Man探针实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素D的方法具有极强的特异性,标准曲线的相关系数为0.999,最低可检测到40copies/m L的阳性质粒,检测乳中产肠毒素D金黄色葡萄球菌的灵敏度为1.0×102CFU/m L。该检测方法具有较好的特异性和灵敏性,在产肠毒素D金黄色葡萄球菌快速筛查方面具有良好的应用前景。

I型牛疱疹病毒gE基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立

以I型牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus-1,BHV-1)的gE基因序列,针对1607～1704 bp区域分别设计1对引物及相应的TaqMan探针,在建立和优化反应体系后,对经10倍系列稀释的病毒进行扩增来检测其灵敏度和特异性。结果表明,建立的荧光定量PCR可用于检测BHV-1,其灵敏度为10 copies/μL,且与其他病毒无交叉反应,可用于BHV-1临床检测。

TaqMan探针荧光定量PCR检测甜菜低温胁迫相关miRNAs

本项研究根据模式植物拟南芥中miR156,157,159,167,319,396在植物中所具有的广泛同源性及其在非生物胁迫环境下可能具有的共同调控机制,采用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术检测低温胁迫下甜菜幼苗同源miRNAs的差异表达,以期揭示甜菜响应低温胁迫的可能分子机制。实验表明,甜菜中存在与拟南芥同源的miR156,157,159,167,319,396基因,miR159基因表达稳定,在本实验中用作定量内参,miR156,157,167,396明显下调,而miR319虽然被认为与miR159属于同一家族,但在甜菜幼苗低温胁迫下表现为明显上调,说明miR156,157,167,319,396是甜菜中响应低温信号的调控分子。本研究首次识别甜菜中存在与拟南芥同源的6个miRNAs,为进一步探索甜菜响应低温胁迫的分子机理奠定了技术。

尖孢镰刀菌TaqMan探针荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用

目的建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，用于临床标本中尖孢镰刀菌的快速诊断。方法针对尖抱镰刀菌的B—tubulin基N。设计特异性引物和探针并构建该基N的重组质粒标准品；优化PCR反应条件，建立尖孢镰刀菌的荧光定量PCR检测方法；通过lO种标准菌株和33株，临床分离株的应用检测，验证该方法的可行性。结果该检测方法具有较好的特异度、敏感度和重复性，6袜尖孢镰刀茵均有明显扩增，而其它37株临床常见的致角膜炎真菌标准株或分离株无明显扩增；最低检出限为408copies／μl，且变异系数低于5％。结论研究成功建立了尖孢镰刀菌的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法，对临床上真菌性角膜炎的快速诊断及指导用药具有实际应用性和重要意义。

血清1型FAdV TaqMan探针荧光定量PCR方法的建立及应用

为特异性地检测家禽中血清1型禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV)的感染,本研究以血清1型FAdV保守的52K基因为模板设计引物和探针,通过矩阵法优化后建立了针对该病毒的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测1日龄SPF鸡攻毒后咽、肛拭子排毒量及组织病毒载量。结果显示,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,只能检测出血清1型FAdV,对其他血清型FAdV和其他禽类病毒均无阳性扩增;最低检测限度低至10拷贝/μL;组间和组内离散度均小于2%;标准曲线为y=-3.836x+41.791,相关系数R2=0.996,具有良好的线性关系;对SPF鸡攻毒结果显示,在攻毒后第1~14日的咽、肛拭子均可检测到血清1型FAdV,在攻毒后第8日的肝脏、肾脏、肌胃、回肠中也可检测到病毒,而腺胃和盲肠中未检出病毒。本研究为血清1型FAdV的定量检测提供了方法。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

猪流行性腹泻病毒锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期痕量检测方法,该研究以PEDV的M基因为靶基因,设计了特异性引物和锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)-TaqMan探针,经过条件优化,建立了基于LNA-TaqMan探针的PEDV荧光定量PCR方法,并与常规TaqMan探针法进行了比对。结果显示,所建立的PEDV的LNA-Taq-Man探针荧光定量PCR方法最低检测限为3.2拷贝/微升,较常规TaqMan探针法提高了10倍;与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒等多种病原不存在交叉反应,特异性良好;批内和批间重复性结果的变异系数均小于1%,重复性较好。应用该方法对103份临床样品进行检测,结果显示,共检出PEDV阳性样品47份,阳性率45.63%,与常规TaqMan探针法检测结果的阳性符合率为90.38%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针的荧光定量PCR方法为PEDV的精准检测和流行病学调查提供了一种新的技术选择。

牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。

牛结核病荧光定量PCR引物探针的组合筛选比较

为比较牛结核病荧光定量PCR(qPCR)不同引物探针组合的特异性和敏感性,验证其临床检测效果,选取国际、国家、行业、地方标准及文献报道的11组qPCR鉴定引物探针组合,采用牛分枝杆菌基因组DNA国家二级标准物质、参考菌株核酸和临床奶样对其进行比较、验证。结果显示:11组引物探针均无非特异性扩增,表现出良好的特异性;国标IS1081引物检测灵敏度最高,最低检测限可达1.4×10^(-1);除国标Mtb(结核分枝杆菌)引物外,其他引物探针组合重复性良好(CV<10%);30份临床样品中国标IS1081引物阳性样品检出率明显高于其他引物。结果表明,国标IS1081引物探针组合特异、灵敏、临床检测效果更优,推荐用于实验室qPCR检测牛结核病。

贵州蓝莓蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

该研究利用TaqMan特异性探针实时荧光PCR检测手段,建立了高效、精准鉴别贵州特色(中蜂)蓝莓蜜的方法。对贵州白竹林、麻卡和乌卡坪三个地域的蓝莓种植区蓝莓蜜进行采集(包括意蜂蓝莓蜜),同时购买市售蜂蜜及加拿大蓝莓蜜,该方法通过采集贵州麻江县白竹林地区蓝莓种植园及蜂场周围蓝莓同花期26种植物样本,基于植物基因组中trnL基因序列的多序列比对,设计蓝莓trnL基因特异性引物,并进行TaqMan探针验证。结果表明,本研究设计的TaqMan探针特异性强,建立的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法能检测到蓝莓花粉DNA最低浓度为0.3 ng/μL;利用建立的方法对11种市售蜂蜜和贵州蓝莓蜜样本进行检测,发现贵州蓝莓蜜的Ct值为24~26,蓝莓花粉数在800~1700颗,其余蜂蜜Ct值在30以上,表明该方法能够有效实现贵州蓝莓蜜和其他蜂蜜的区分,具有良好的应用前景。

应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术快速检测青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌耐链霉素基因

目的 应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术快速检测青海省海西州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐链霉素基因,为今后该地区突发人间鼠疫的精准临床用药提供理论依据。方法 分离培养海西地区1957—2009年间取自鼠疫患者、媒介昆虫及中间宿主的代表性鼠疫菌110株,提取其DNA,针对我国链霉素耐药基因rpsl基因设计引物P-F和P-R和TaqMan-MGB探针Probe1 [FAM]和Probe2[VIC],利用荧光定量PCR技术,进行耐药rpsl基因筛查。结果 110株被试菌株中FAM检测均为阳性(RFU峰值>2000);VIC阳性的为0株(RFU峰值<200)。阳性对照和空白对照成立。结论 实时荧光定量PCR结果显示,该地区未检测出耐链霉素菌株。

诺如病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的设计与优化

为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通过正交试验进行程序及试剂反应体系的优化,设计TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明该检测方法具有高灵敏度,最低检测限可达1.2 copies/μL,且在标准重组质粒浓度1.2×10^(5)~1.2×10^(0) copies/μL范围内具有较好的线性关系,其R^(2)=0.9907;该方法特异性强,在病毒的混合重组质粒样液中仅与NV病毒反应;组内和组间的重复性良好,变异系数(CV)值均小于2%;在数字PCR试验中进一步验证了该方法的可行性.本文设计的TaqMan荧光定量PCR检测方法可用于NV毒株的快速准确检测,有望成为NV诊断的有效工具.