一种基于ITR序列的羊痘病毒TaqMan探针荧光PCR检测方法的建立

为了建立一种快速检测羊痘病毒的方法,试验根据羊痘病毒[绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)]末端反向重复(ITR)序列的保守区设计了1对特异引物和TaqMan探针,通过优化反应体系建立了一种检测羊痘病毒的TaqMan探针荧光PCR检测方法。结果表明:该方法对羊痘病毒具有良好的特异性,不与猪痘病毒(SWPV)、鸡痘病毒(FPV)、羊传染性脓疱皮炎病毒(ORFV)及口蹄疫病毒(FMDV)发生交叉反应。该方法对质粒标准对照(PCR^2.1-GPTV-ITR)的最适线性检测范围为2.3×10~1~2.3×10~8拷贝/μL,标准曲线方程为Y=-3.416 2X+38.605,相关系数(R^2)为0.999 9,检测下限为23拷贝数。对3个不同浓度的PCR^2.1-GPTV-ITR进行组内试验和组间试验检测,每个浓度的重复试验Ct值的变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对来自安徽、广西和天津地区的36份临床样本进行羊痘病毒检测,其中18份样本羊痘病毒核酸检测为阳性。说明本方法可用于羊痘病毒快速、准确检测。

Taqman探针荧光PCR检测鲨鱼源性成分

针对鲨鱼产品掺杂造假增多而缺乏有效鉴定技术的情况,作者根据Gen Bank中鲨鱼基因的线粒体DNA(mt DNA)序列,使用分子生物学软件Primer Express 2.0设计了一套特异性引物和探针,用来建立Taqman探针荧光PCR检测鲨鱼源性成分的方法。结果表明,对13份已鉴定为鲨鱼鱼翅的样品进行检测,全部出现特异性扩增曲线,阴性对照没有荧光增长。方法特异性强,对市场购买的12份鲨鱼源性样品及9份其他鱼类样品进行检测,12份鲨鱼样品均出现荧光扩增曲线,而非鲨鱼样品均未出现荧光增长;方法灵敏度较高,可检测到的最低质粒拷贝数量级为10拷贝/μL;方法快速准确,操作简便,重复性好,稳定可靠,可应用于市场上鱼翅等常见鲨鱼源性产品的真假鉴定。

犬冠状病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。针对CCoV的3′UTR与CPV的VP2设计引物与探针,通过对反应体系与条件进行优化,建立了CCoV与CPV的双重荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重复性验证与临床样品检验。结果:CCoV与CPV阳性参考质粒浓度在10^(2)~10^(7) copies/μL,CCoV与CPV的标准曲线R^(2)分别为0.999与0.996,线性关系良好,CCoV与CPV的最低检测限均为5 copies/μL,与其他病原无交叉反应,组内与组间的变异系数均小于1.38%,说明该方法灵敏度高、特异性强、重复性良好;对113份临床样本进行检测,与普通PCR比较,该方法对CCoV和CPV的检出率较高,分别为37.2%和40.7%。研究表明,本试验建立的CCoV和CPV双重荧光定量PCR方法检测效果良好,为相关疾病的临床诊断、流行病调查等提供了有力工具。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立

尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。

塔城病毒Ⅰ型TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法的建立

建立快速特异的蜱传塔城病毒Ⅰ型(TcTV-Ⅰ)荧光定量PCR检测方法,用于TcTV-Ⅰ的初步筛查。选用TcTV-Ⅰ糖蛋白G基因设计特异性引物以及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,与TcTV-Ⅱ、新布尼来病毒(Severe fever with thrombocytopenia virus,SFTSV)、森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)、大别山病毒(Dabieshan orthohanta virus,DBSV)、阿龙山病毒(Alongshan virus,ALSV)等常见蜱传病毒均无交叉反应;标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板拷贝数之间呈良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.9999;具有良好的敏感性,最低检测限为1.10×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规PCR的10^(3)倍;具有较好的稳定性,组内和组间的变异系数均低于2%。采用本方法对辽宁、内蒙古及新疆地区的425份蜱样本就行检测,只有新疆地区的19份蜱样本呈阳性。结果表明本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可用于TcTV-Ⅰ的快速检测、流行病学调查和疫情监测等。

鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。

贵州蓝莓蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

该研究利用TaqMan特异性探针实时荧光PCR检测手段,建立了高效、精准鉴别贵州特色(中蜂)蓝莓蜜的方法。对贵州白竹林、麻卡和乌卡坪三个地域的蓝莓种植区蓝莓蜜进行采集(包括意蜂蓝莓蜜),同时购买市售蜂蜜及加拿大蓝莓蜜,该方法通过采集贵州麻江县白竹林地区蓝莓种植园及蜂场周围蓝莓同花期26种植物样本,基于植物基因组中trnL基因序列的多序列比对,设计蓝莓trnL基因特异性引物,并进行TaqMan探针验证。结果表明,本研究设计的TaqMan探针特异性强,建立的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法能检测到蓝莓花粉DNA最低浓度为0.3 ng/μL;利用建立的方法对11种市售蜂蜜和贵州蓝莓蜜样本进行检测,发现贵州蓝莓蜜的Ct值为24~26,蓝莓花粉数在800~1700颗,其余蜂蜜Ct值在30以上,表明该方法能够有效实现贵州蓝莓蜜和其他蜂蜜的区分,具有良好的应用前景。

基于TaqMan MGB探针的菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法

菊花花枯病菌已被列入我国进境植物检疫性有害生物名录。目前,随着真菌分类系统的调整以及“一菌一名”原则的实施,菊花花枯病菌及其近似种分类地位已经发生了重大调整。本研究根据菊花花枯病菌模式菌株与其近似种ITS序列的差异,设计了可特异性检测菊花花枯病菌的引物SL1/SL2和探针Probe-M,建立了菊花花枯病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,供试菌株中仅菊花花枯病菌有阳性扩增,而其他供试菌株及空白对照均无荧光信号增加。灵敏度试验结果表明,在20μL反应体系内,检测灵敏度可达到26 fg/μL DNA。该方法特异性强、灵敏度高、检测速度快,整个检测过程在1.5 h内完成,满足了口岸对菊花花枯病菌快速检疫鉴定的需求。

新型鹅细小病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

为快速高效地检测新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),试验根据NGPV VP3基因序列设计特异性引物及探针,以NGPV KC3S3株提取的DNA为模板,在构建质粒标准品的基础上,建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法的标准曲线为y=-3.0816x+35.389,相关系数(R^(2))为0.9981,质粒标准品浓度为1.0×10^(2)~1.0×10^(8) copies/µL时具有良好的线性关系;该方法对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、星状病毒(Astrovirus,AstV)、小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)、禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV)等鸭常见病毒性病原均无特异性扩增;所设计引物及探针的基因序列与GPV及MDPV的相同区域有4~11个碱基发生突变,可以避免GPV及MDPV对检测结果的影响;该方法批内和批间检测变异系数(CV)均小于1.5%,对66份疑似感染NGPV鸭的肝脏样品检测阳性率为59.1%,高于常规PCR检测结果(31.8%)。结果表明,研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以有效区分GPV与MDPV,在NGPV感染的临床诊断和早期防控方面具有良好的应用前景。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

植原体TaqMan探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

本研究成功建立了植原体分类鉴定和检测的 Taq Man探针实时荧光 PCR方法 ,该方法根据植原体 16S r DNA保守区设计了 1个 Taq Man广谱探针和 3个植原体组间点突变特异性探针 ,并对 9种植原体和 5种细菌以及 3个植物样本进行实时荧光 PCR。结果表明 ,用广谱探针可检测到所有植原体产生荧光信号 ,而细菌不产生荧光信号。当用植原体组间特异性探针检测时 ,仅能检测到该组植原体产生荧光信号 ,检测的敏感性比常规的 PCR-电泳检测高约 10 0倍、检测速度有较大提高。由于PCR产物是荧光探针检测 ,本方法特异性强 ,并可以用组特异探针直接确定植原体种类。实验采用完全闭管检测 ,降低了污染机会。本研究为其它原核生物、特别是不能培养菌。

toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌

以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;所制作的标准曲线在2.5×101～2.5×106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析。结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h,是快速检测副溶血弧菌的有效手段。

基于TaqMan探针的蜜蜂囊状幼虫病病毒荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立快速有效的蜜蜂囊状幼虫病检疫方法,依据TaqMan荧光标记探针技术原理,针对蜜蜂囊状幼虫病病毒保守序列,设计出一对特异性引物和一条探针,建立了一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病病毒的荧光PCR方法。该方法对蜜蜂囊状幼虫病的检测具有较好的特异性,与蜜蜂急性麻痹病病毒、蜜蜂慢性麻痹病病毒、蜜蜂残翼病病毒和黑蜂王台病病毒之间均无交叉反应。检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL阳性质粒,可对低病毒含量的样品进行准确检测。重复性和稳定性试验结果显示,变异系数为1.6%,说明该方法具有较好的重复性和稳定性。应用该方法对蜜蜂及蜂制品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法4h内即可报告检测结果,该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等优点,适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂囊状幼虫病病毒的快速检疫。

Taqman探针实时荧光定量PCR检测肝脏疾病患者血清中miR-122的表达水平及其临床意义

目的:运用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测肝脏疾病患者血清中miR-122的表达水平并探讨其临床意义。方法:设计miR-122及U6 snRNA的茎环引物和Taqman探针,运用Taqman探针实时荧光定量PCR检测27例肝癌术前(HCC)患者、15例乙型肝炎(hepatitis B)患者、15例丙型肝炎(hepatitis C)患者、15例正常对照者(HC)、11例肝癌术后(PHCC)患者及10例肝癌术后复发(recurrence)患者血清中miR-122的表达水平,并分析miR-122与肝脏疾病相关标志物的关系。结果:Taqman探针实时荧光定量PCR方法能检测血清中miR-122的表达。HCC、hepatitis B、hepatitis C及recurrence患者血清中miR-122的表达水平均高于HC和PH-CC患者(P<0.05),hepatitis C患者血清miR-122表达水平高于HCC、hepatitis B和recurrence患者(P<0.05),但HCC、hepatitis B和recurrence患者血清miR-122的表达水平无明显差异(P>0.05),PHCC患者血清miR-122的表达水平比HCC和recurrence患者低(P<0.05)。血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性和(或)乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性患者血清miR-122的表达水平高于阴性者(P<0.05)。血清丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)阳性患者血清miR-122的表达水平高于阴性者(P<0.05)。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)与miR-122的表达水平有正相关性(r=0.34,P<0.05)。血清甲胎蛋白(AFP)≥400μg/L组血清miR-122的表达高于AFP<400μg/L组(P<0.05)。结论:Taqman探针实时荧光定量PCR适用于检测血清miR-122的表达水平。在HCC、hepatitis B、hepatitisC及recurrence患者血清中miR-22均有不同程度的增高,尤其是hepatitis C患者,且PHCC患者血清miR-122表达下降,复发后升高。血清miR-122的表达与肝脏疾病的某些指标有关,提示血清miR-122可作为肝脏疾病,特别是肝癌早期诊断、手术疗效及预后判断的新指标。

ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌,传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析,选取相对保守且高度特异的DNA序列,设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,对比现有的检测方法,以ETA基因为靶基因,基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点,具有很好的研究价值和应用前景。

TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测西瓜潜隐病毒

【目的】西瓜潜隐病毒(Citrullus lanatus cryptic virus,CiLCV)是近年来新发生的一种重要种传病害,研究旨在建立基于TaqMan探针法的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR with TaqMan probes,TaqMan-qPCR)检测技术,为开展种子、种苗带毒鉴定和病害防控提供技术支撑。【方法】通过基于小RNA高通量测序技术在北京西瓜产地发现了CiLCV,并克隆CiLCV的dsRNA1和dsRNA2全长序列,设计特异性引物建立RT-PCR和TaqMan-qPCR检测方法。以黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottled mosaic virus)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、甜瓜内源病毒(Cucumis melo endornavirus)、瓜类褪绿病毒(cucurbit chlorotic yellows virus)、南瓜花叶病毒(squash mosaic virus)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、西瓜花叶病毒(watermelon mosaic virus)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus)8种常见病毒为对照进行检测方法特异性分析;利用建立的实时荧光定量标准曲线对方法灵敏度进行评价;进一步利用TaqMan-qPCR和RT-PCR技术监测我国葫芦科作物主产区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗带毒情况。【结果】通过分析获得的高质量小RNA数据,发现17条组装的contig与CiLCV基因组有较好同源性。进一步克隆获得CiLCV的dsRNA1和dsRNA2序列全长(分别为1603和1466 nt),发现其与河南省鉴定出的CiLCV同源性高达99.4%和99.8%(GenBank number KY081285、KY081284)。建立的RT-PCR检测技术对CiLCV有单一扩增条带;建立的TaqMan-qPCR检测技术具有较好特异性和灵敏度,且能够检测到最低拷贝数为2×10^(3)的病毒,灵敏度是RT-PCR的100倍。同时,发现有1份来自北京的西瓜种苗检出了CiLCV,而其余地区的西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜(砧木)种苗均未检出该病毒,表明我国葫芦科作物主产区种苗带毒情况总体不高。【结论】建立的TaqMan-qPCR检测CiLCV技术特异性强、灵敏度高,适用于口岸和实验室开展CiLCV快速检测和精准鉴定。鉴于CiLCV可以通过种子、种苗等传播方式快速扩散,我国应重视种子、种苗的带毒检测,防止带毒种子、种苗流入生产环节进而调运扩散至全国,给产业造成重大经济损失。

免疫凝聚试纸条和TaqMan探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究

以西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）菌悬液和田间采集的病组织为试材，研究了免疫凝聚试纸条和实时荧光PCR技术检测的灵敏度和适应性。结果表明，免疫凝聚试纸条检测灵敏度为10^6 cfu／mL，具有简便、快速、易操作特点，适用于田间快速检测和病害诊断；TaqMan探针实时荧光PCR检测灵敏度达10^3～4 cfu／mL，比传统PCR检测灵敏度（10^5 cfu／mL）提高了10～100倍，且不需要琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和Southern杂交。但需要昂贵的仪器和试剂，适用于室内检测及相关研究。

TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌

目的利用新一代TaqMan MGB探针技术,建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于布鲁氏菌的快速检测。方法针对布鲁氏菌基因组中16SrRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套基于TaqMan MGB探针技术的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性,对2008-2010年期间采集的773份动物样本中的布鲁氏菌进行检测,并与普通PCR方法进行比较分析。结果建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对布鲁氏菌的检测具有高度的特异性,对小肠结肠耶尔森菌、假结核耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲菌、泰泽氏菌均无交叉反应。生成的标准曲线的相关系数为0.999,斜率为-3.301,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR效率为100.872%。TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能够准确地从布鲁氏菌阳性样本中检测到布鲁氏菌DNA,最低能够检测到的布鲁氏菌数量为9.3拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高100倍。对773份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR能检出53份布鲁氏菌阳性样本,而常规PCR只检出37份阳性。结果显示,TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比常规PCR方法更敏感,能够直接从动物样本中检出布鲁氏菌DNA,检测时间仅为2h。结论本研究首次建立了直接用于检测动物样本中布鲁氏菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,该技术适用于传染性病原体的快速检测与鉴定。