尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立

尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

塔城病毒Ⅰ型TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法的建立

建立快速特异的蜱传塔城病毒Ⅰ型(TcTV-Ⅰ)荧光定量PCR检测方法,用于TcTV-Ⅰ的初步筛查。选用TcTV-Ⅰ糖蛋白G基因设计特异性引物以及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,与TcTV-Ⅱ、新布尼来病毒(Severe fever with thrombocytopenia virus,SFTSV)、森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)、大别山病毒(Dabieshan orthohanta virus,DBSV)、阿龙山病毒(Alongshan virus,ALSV)等常见蜱传病毒均无交叉反应;标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板拷贝数之间呈良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.9999;具有良好的敏感性,最低检测限为1.10×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规PCR的10^(3)倍;具有较好的稳定性,组内和组间的变异系数均低于2%。采用本方法对辽宁、内蒙古及新疆地区的425份蜱样本就行检测,只有新疆地区的19份蜱样本呈阳性。结果表明本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可用于TcTV-Ⅰ的快速检测、流行病学调查和疫情监测等。

鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。

贵州蓝莓蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

该研究利用TaqMan特异性探针实时荧光PCR检测手段,建立了高效、精准鉴别贵州特色(中蜂)蓝莓蜜的方法。对贵州白竹林、麻卡和乌卡坪三个地域的蓝莓种植区蓝莓蜜进行采集(包括意蜂蓝莓蜜),同时购买市售蜂蜜及加拿大蓝莓蜜,该方法通过采集贵州麻江县白竹林地区蓝莓种植园及蜂场周围蓝莓同花期26种植物样本,基于植物基因组中trnL基因序列的多序列比对,设计蓝莓trnL基因特异性引物,并进行TaqMan探针验证。结果表明,本研究设计的TaqMan探针特异性强,建立的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法能检测到蓝莓花粉DNA最低浓度为0.3 ng/μL;利用建立的方法对11种市售蜂蜜和贵州蓝莓蜜样本进行检测,发现贵州蓝莓蜜的Ct值为24~26,蓝莓花粉数在800~1700颗,其余蜂蜜Ct值在30以上,表明该方法能够有效实现贵州蓝莓蜜和其他蜂蜜的区分,具有良好的应用前景。

新型鹅细小病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

为快速高效地检测新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV),试验根据NGPV VP3基因序列设计特异性引物及探针,以NGPV KC3S3株提取的DNA为模板,在构建质粒标准品的基础上,建立TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示:该方法的标准曲线为y=-3.0816x+35.389,相关系数(R^(2))为0.9981,质粒标准品浓度为1.0×10^(2)~1.0×10^(8) copies/µL时具有良好的线性关系;该方法对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、星状病毒(Astrovirus,AstV)、小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)、禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAV)等鸭常见病毒性病原均无特异性扩增;所设计引物及探针的基因序列与GPV及MDPV的相同区域有4~11个碱基发生突变,可以避免GPV及MDPV对检测结果的影响;该方法批内和批间检测变异系数(CV)均小于1.5%,对66份疑似感染NGPV鸭的肝脏样品检测阳性率为59.1%,高于常规PCR检测结果(31.8%)。结果表明,研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以有效区分GPV与MDPV,在NGPV感染的临床诊断和早期防控方面具有良好的应用前景。

CT联合TaqMan探针法对不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的诊断价值

目的:探讨计算机断层成像(CT)联合Taq Man探针法对不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的诊断价值。方法:收集2020年3月至2023年3月石家庄市妇幼保健院收治的80例支原体肺炎患儿的病历资料,依据患儿年龄分为<1岁组(29例)、1~3岁组(23例)和>3岁组(28例);根据入院病程不同分为长病程组(43例,病程>7 d)和短病程组(37例,病程≤7 d)。对所有支原体肺炎患儿均进行CT联合TaqMan探针法检测心肺损伤情况,分析不同年龄组和病程组患儿的心肺损害发生率。采用CT和Taq Man探针检测胸腔积液、心肌厚度、心胸比、支原体核酸表达水平相关指标,采用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分析CT和探针检测支原体肺炎患者心肺损害的诊断价值。结果:CT成像显示,80例患儿中诊断准确率为93.75%(75/80),其中62.5%(50/80)的患儿存在典型的肺部异常。主要为肺部磨玻璃结节(GGO)、合并细菌性肺炎和网状。在小部分患儿中发现了支气管扩张。肺部异常患儿发现双侧肺部受累,其中下叶受累最明显。在临床上怀疑偶发性肺栓塞(PE)的38名患儿,进行了额外的造影剂CT,检测到24例患儿偶发性PE,诊断准确率为63.15%(24/38);采用TaqMan探针法检测支原体感染,建立了高灵敏度和宽动态范围的检测系统,在0.2~0.2×10^(-5)之间进行6次10倍稀释。在1 ng/μl微生物群落(MMC)-DNA标准品中制备,6次log10稀释度的高线性动态范围,回归系数为R^(2)=1。发现DNA检测下限为2×10-15g/μl;不同年龄支原体肺炎患儿随着年龄的增加,心肺损害发生率逐渐降低;<1岁组、1~3岁组和>3岁组支原体肺炎患儿心肺损害发生率分别为93.10%、73.91%和21.43%,3组比较差异有统计学意义(x^(2)=7.660、33.019,P<0.05)。长病程组心肺损害发生率(93.02%)明显高于短病程组(27.03%),差异有统计学意义(x^(2)=12.070、36.960,P<0.05)。心肺损害组患儿的胸腔积液量明显高于非心肺损害组,同时心肺损害组的心肌厚度显著增加,心胸比也显著高于非心肺损害组,以及支原体核酸表达水平比较差异具有统计学意义(t=9.52、3.33、4.22、10.00,P<0.05)。ROC曲线分析显示,CT联合TaqMan探针法诊断不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的AUC均>0.5,且联合诊断的AUC最大。结论:CT联合TaqMan探针法对支原体肺炎患儿的心肺损害具有较高的诊断价值。对于支原体肺炎临床症状持续存在的患儿,应考虑进行心肺损害诊断。改编现有的TaqMan探针法,进一步扩展dPCR检测组合,将改进微生物诊断工具箱,并为支原体肺炎患儿心肺损伤的治疗决策提供可靠的定量数据。

植原体TaqMan探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

本研究成功建立了植原体分类鉴定和检测的 Taq Man探针实时荧光 PCR方法 ,该方法根据植原体 16S r DNA保守区设计了 1个 Taq Man广谱探针和 3个植原体组间点突变特异性探针 ,并对 9种植原体和 5种细菌以及 3个植物样本进行实时荧光 PCR。结果表明 ,用广谱探针可检测到所有植原体产生荧光信号 ,而细菌不产生荧光信号。当用植原体组间特异性探针检测时 ,仅能检测到该组植原体产生荧光信号 ,检测的敏感性比常规的 PCR-电泳检测高约 10 0倍、检测速度有较大提高。由于PCR产物是荧光探针检测 ,本方法特异性强 ,并可以用组特异探针直接确定植原体种类。实验采用完全闭管检测 ,降低了污染机会。本研究为其它原核生物、特别是不能培养菌。

toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌

以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;所制作的标准曲线在2.5×101～2.5×106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析。结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h,是快速检测副溶血弧菌的有效手段。

基于TaqMan探针的蜜蜂囊状幼虫病病毒荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立快速有效的蜜蜂囊状幼虫病检疫方法,依据TaqMan荧光标记探针技术原理,针对蜜蜂囊状幼虫病病毒保守序列,设计出一对特异性引物和一条探针,建立了一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病病毒的荧光PCR方法。该方法对蜜蜂囊状幼虫病的检测具有较好的特异性,与蜜蜂急性麻痹病病毒、蜜蜂慢性麻痹病病毒、蜜蜂残翼病病毒和黑蜂王台病病毒之间均无交叉反应。检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL阳性质粒,可对低病毒含量的样品进行准确检测。重复性和稳定性试验结果显示,变异系数为1.6%,说明该方法具有较好的重复性和稳定性。应用该方法对蜜蜂及蜂制品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法4h内即可报告检测结果,该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等优点,适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂囊状幼虫病病毒的快速检疫。

基于TaqMan探针的Real-timePCR定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。在本文基于LightCycler为平台 ,建立一种基于TaqMan探针的Real_timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时 ,发现所有空肠弯曲杆菌 (11株 )都呈阳性 ,所有其它弯曲菌 (3株 )和其它菌株 (5株 )都是阴性。整个检测过程 6 0min内可以完成 ,检测限度为5CFU ,标准曲线的相关系数为 0 .988。结果表明荧光定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法 ,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。

TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测登革病毒

目的建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue Virus, DV)鉴定方法.方法根据DV 3'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针.利用1998～2004年收集的26份登革热病人临床血清标本,15例乙脑病人血清,DV 4个血清型标准毒株及23株1978～1997年DV 地方流行株和相关西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒等毒株,同时用克隆了1型DV 基因组3'端非编码区序列片段的质粒DNA作为阳性对照,检测所建立方法的特异性、敏感性.结果所建立方法的最低检测限约为每反应5个基因拷贝.用该方法检测4个血清型DV 标准毒株、23株DV 地方流行株和26例分离到DV 的阳性血清标本,检出率为100 %;用该方法检测15例乙脑病人血清、10例麻疹病人血清和西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒,结果均为阴性.结论新建的TaqMan MGB探针检测DV 方法是实验室早期诊断登革热较理想的方法.

Taqman探针实时荧光定量PCR检测肝脏疾病患者血清中miR-122的表达水平及其临床意义

目的:运用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测肝脏疾病患者血清中miR-122的表达水平并探讨其临床意义。方法:设计miR-122及U6 snRNA的茎环引物和Taqman探针,运用Taqman探针实时荧光定量PCR检测27例肝癌术前(HCC)患者、15例乙型肝炎(hepatitis B)患者、15例丙型肝炎(hepatitis C)患者、15例正常对照者(HC)、11例肝癌术后(PHCC)患者及10例肝癌术后复发(recurrence)患者血清中miR-122的表达水平,并分析miR-122与肝脏疾病相关标志物的关系。结果:Taqman探针实时荧光定量PCR方法能检测血清中miR-122的表达。HCC、hepatitis B、hepatitis C及recurrence患者血清中miR-122的表达水平均高于HC和PH-CC患者(P<0.05),hepatitis C患者血清miR-122表达水平高于HCC、hepatitis B和recurrence患者(P<0.05),但HCC、hepatitis B和recurrence患者血清miR-122的表达水平无明显差异(P>0.05),PHCC患者血清miR-122的表达水平比HCC和recurrence患者低(P<0.05)。血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性和(或)乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性患者血清miR-122的表达水平高于阴性者(P<0.05)。血清丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)阳性患者血清miR-122的表达水平高于阴性者(P<0.05)。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)与miR-122的表达水平有正相关性(r=0.34,P<0.05)。血清甲胎蛋白(AFP)≥400μg/L组血清miR-122的表达高于AFP<400μg/L组(P<0.05)。结论:Taqman探针实时荧光定量PCR适用于检测血清miR-122的表达水平。在HCC、hepatitis B、hepatitisC及recurrence患者血清中miR-22均有不同程度的增高,尤其是hepatitis C患者,且PHCC患者血清miR-122表达下降,复发后升高。血清miR-122的表达与肝脏疾病的某些指标有关,提示血清miR-122可作为肝脏疾病,特别是肝癌早期诊断、手术疗效及预后判断的新指标。

TaqMan MGB探针实时检测兔病毒性出血症病毒

应用荧光定量PCR技术,根据兔病毒性出血症病毒的保守基因VP60设计了1对引物和1段Taqman MGB探针,建立了用于检测兔病毒性出血症病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5 pg,未检出其他病原的RNA。试验结果表明,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的兔病毒性出血症病毒,适合于兔各脏器及肌肉组织中兔病毒性出血症病毒的快速诊断和检测。

ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌,传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析,选取相对保守且高度特异的DNA序列,设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,对比现有的检测方法,以ETA基因为靶基因,基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点,具有很好的研究价值和应用前景。

TaqMan探针技术用于X-SNP位点的分型

目的建立一种基于TaqMan探针技术的快速、准确且经济的实时荧光PCR方法,用于检测X染色体上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。方法选择X染色体上的13个SNP位点(X-SNP),针对每个位点分别设计1对PCR引物和TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增,对X-SNP位点进行分型。结果13个位点均符合Hardy-Weinberg平衡;多态信息含量分布为0.3497～0.3750,杂合度为0.4537～0.5021。建立的方法能够用于X-SNP位点的基因分型,检测结果与DNA测序结果完全一致。结论基于TaqMan探针技术的等位基因特异的实时荧光PCR方法灵敏、简单、快速,可实现对X-SNP位点的分型检测;所选择的13个X-SNP位点具有高信息量,在法医遗传学中具有潜在的应用价值。

TaqMan探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的:在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法:选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果:支原体PCR产物大小约为288bp,质粒质量浓度为13.9mg·mL-1,A260/A280(Ratio)为1.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝.μL-1。10μmol.L-1的引物浓度和10μmol.L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式:Ct=-2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论:支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。

免疫凝聚试纸条和TaqMan探针实时荧光PCR检测西瓜细菌性果斑病菌比较研究

以西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）菌悬液和田间采集的病组织为试材，研究了免疫凝聚试纸条和实时荧光PCR技术检测的灵敏度和适应性。结果表明，免疫凝聚试纸条检测灵敏度为10^6 cfu／mL，具有简便、快速、易操作特点，适用于田间快速检测和病害诊断；TaqMan探针实时荧光PCR检测灵敏度达10^3～4 cfu／mL，比传统PCR检测灵敏度（10^5 cfu／mL）提高了10～100倍，且不需要琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色和Southern杂交。但需要昂贵的仪器和试剂，适用于室内检测及相关研究。

玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR

为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高,可以快速、直接检测植物病原菌的方法,将玉米细菌性枯萎病菌16SrDNA基因克隆测序,根据该细菌与其他细菌菌株16SrDNA序列差异,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针,除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外,还对假单胞菌属1个种,黄单胞菌属1个种,棒形杆菌属1个种,短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测.结果表明:只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,其他细菌和植原体都没有荧光产生.检测的灵敏度为104CFU/mL的菌悬浮液,相当于4个细菌细胞的基因,灵敏度高,也就是说,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR就能检测到.相对灵敏度为107CFU/mL,而且整个检测过程只需2h,由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统,不用凝胶电泳,降低了污染.

Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒

选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqm an探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV。利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80。pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线。以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测。该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数。PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出。用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒。建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测。