犬冠状病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。针对CCoV的3′UTR与CPV的VP2设计引物与探针,通过对反应体系与条件进行优化,建立了CCoV与CPV的双重荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重复性验证与临床样品检验。结果:CCoV与CPV阳性参考质粒浓度在10^(2)~10^(7) copies/μL,CCoV与CPV的标准曲线R^(2)分别为0.999与0.996,线性关系良好,CCoV与CPV的最低检测限均为5 copies/μL,与其他病原无交叉反应,组内与组间的变异系数均小于1.38%,说明该方法灵敏度高、特异性强、重复性良好;对113份临床样本进行检测,与普通PCR比较,该方法对CCoV和CPV的检出率较高,分别为37.2%和40.7%。研究表明,本试验建立的CCoV和CPV双重荧光定量PCR方法检测效果良好,为相关疾病的临床诊断、流行病调查等提供了有力工具。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

诺如病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的设计与优化

为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通过正交试验进行程序及试剂反应体系的优化,设计TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明该检测方法具有高灵敏度,最低检测限可达1.2 copies/μL,且在标准重组质粒浓度1.2×10^(5)~1.2×10^(0) copies/μL范围内具有较好的线性关系,其R^(2)=0.9907;该方法特异性强,在病毒的混合重组质粒样液中仅与NV病毒反应;组内和组间的重复性良好,变异系数(CV)值均小于2%;在数字PCR试验中进一步验证了该方法的可行性.本文设计的TaqMan荧光定量PCR检测方法可用于NV毒株的快速准确检测,有望成为NV诊断的有效工具.

羊口疮、小反刍兽疫、羊痘病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种羊口疮病毒(ORFV)、山羊痘病毒(GTPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)三种病原的联合共检方法,以ORFV、GTPV和PPRV基因序列为模板,克隆得ORFV-B2L、GTPV-p32、PPRV-N基因序列,并构建三种病原核酸标准品,设计三对探针,建立ORFV、GTPV和PPRV三重TaqMan荧光定量PCR方法,然后对方法的检测条件进行优化及质量评价,并作临床初步验证。结果显示:所建立的ORFV、GTPV和PPRV三重TaqMan荧光定量PCR方法的特异性好,ORFV、PPRV和GTPV最低检测限值分别为2.98×101、3.81×101、6.68×10^(1)copies/μL;稳定性好,与商品化检测试剂盒和OIE标准相比具有较高的检测符合率;对279份临床样本作检测,ORFV、PPRV和GTPV的阳性检出率分别为34%、4.3%、2.5%,ORFV和GTPV的混合感染率为2.5%。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

犬瘟热病毒和犬腺病毒2型双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立犬瘟热病毒(CDV)和犬腺病毒2型(CAdV-2)双重TaqMan荧光定量PCR(RT-qPCR)检测方法。本试验针对CDV的N基因和CAdV-2的E3基因设计两对特异性引物与两条标记不同荧光基团的TaqMan-MGB探针,对引物、探针的浓度、反应体系和反应条件进行优化后检测该方法的灵敏度,特异性及重复性。结果:该方法在CDV和CAdV-2阳性参考质粒浓度1×10^(1)~1×10^(7) copies/μL的范围中,R2值为0.997和0.993,表明所建的标准曲线具有良好线性关系,能检测到最低浓度为5 copies/μL,并对其他病原无扩增现象,特异性良好;重复性试验中组内和组间变异系数小于1.54%。综上,建立的双重TaqMan RT-qPCR检测方法具有灵敏度高且特异性好等优点,可用于CDV和CAdV-2临床快速检测和鉴别诊断及流行病学调查等领域。

非洲马瘟病毒和西尼罗病毒双重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种可同时检测非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)和西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)的双重荧光定量RT-PCR检测方法。根据AHSV VP 7基因序列和WNV Poly Protein基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,优化反应条件及体系,绘制标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行测定,并采用该方法对临床样品进行检测验证。结果显示:该方法能够同时检测AHSV和WNV,且特异性良好,与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马传染性贫血病毒、马腺疫链球菌、马流感病毒等马病核酸均无交叉反应;敏感性高,AHSV和WNV最低检测限均为10 copies·μL^(-1);组内变异系数为0.04%~0.93%,组间变异系数为0.17%~4.83%,重复性良好;使用该方法对30份马全血样品进行检测,结果均为阴性。本试验建立的检测方法对马属动物检疫、非洲马瘟和西尼罗热的监测与防控具有重要意义。

羊贝氏柯克斯体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)实时荧光定量PCR方法,根据GenBank上收录的C.burnetii RSA439株com1基因序列(CP040059.1)保守区设计特异性引物和探针,并构建重组质粒及优化反应条件,以期建立一种检测贝氏柯克斯体的Taq Man荧光定量PCR方法。结果显示,该方法所建立标准曲线线性关系良好;敏感性试验结果显示,最低检出限为2.45×10^(2) copies/μL,与PCR最低检出限为2.45×10^(4) copies/μL相比较,灵敏度提高了100倍;对羊支原体、羊流产衣原体、羊布鲁氏菌等均无交叉反应,批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于3%,说明特异性、重复性好;利用该方法对收集的126份样品进行检测,结果显示样品阳性率为9.52%,常规PCR检测阳性率为7.14%,符合率为90.47%。该方法可为贝氏柯克斯体临床上快速检测及防控提供技术支持。

奶牛乳房炎大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌三重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测奶牛乳房炎主要革兰氏阴性致病菌的快速诊断方法,选择大肠埃希氏菌phoa基因,肺炎克雷伯菌rcsa基因以及奇异变形杆菌urer基因设计合成特异性引物与探针,建立了奶牛乳房炎大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌三重Taq Man荧光定量PCR检测方法。该方法可在120 min内通过一管反应体系特异性鉴定出3种常见的奶牛乳房炎革兰氏阴性致病菌,最低检测限可达1×10^(1)copies/μL且特异性和重复性良好,以此方法对80份奶牛乳房炎生乳样进行检测,大肠埃希氏菌检出率为35%(28/80),肺炎克雷伯菌检出率为21.2%(17/80),奇异变形杆菌检出率为11.2%(9/80)。结果表明,所建立的奶牛乳房炎大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌三重Taq Man荧光定量PCR检测方法具有操作简单、特异性强、灵敏度高的特点,适用于奶牛乳房炎的临床诊断,对革兰氏阴性致病菌的快速检测及合理用药具有指导意义。

猪δ冠状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。参照GenBank中PDCoV有关基因序列,设计一对特异性引物用于扩增PDCoV M 基因。将测序正确的基因片段克隆入pMD18-T载体,构建重组质粒作为建立标准曲线的病毒模板。设计合成一对特异性引物与TaqMan探针,进行反应条件和反应体系的优化,建立快速检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并进行该方法的灵敏性、特异性与重复性验证。结果表明,该方法能有效扩增1.0×10^1 ~1.0×10^9 拷贝·μL^-1 的PDCoV标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系。该方法的检测灵敏度为1.0×10^1 拷贝·μL^-1;对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等病原不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%,重复性良好。对2017—2018年期间收集的河南省不同猪场的100份腹泻病料进行检测,PDCoV的阳性检出率为23%(23/100),与PDCoV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的符合率为100%。人工感染PDCoV的仔猪,取攻毒后不同时间的粪便样品,应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度远远优于常规RT-PCR。上述结果表明,本研究所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法能够灵敏、特异地检测PDCoV,可用于临床PDCoV的检测。

胞内劳森菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪胞内劳森菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,针对胞内劳森菌的16SrDNA基因设计合成特异性的引物和TaqMan探针,经过优化各项反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法仅对胞内劳森菌靶基因有信号,其相关性方程为Ct=-3.318×log(conc)+38.840(R2=0.998),具有良好的线性关系,对标准质粒最低检出量为5.55copies·μL-1,组内样品的变异系数低于2%。表明该TaqMan荧光定量PCR方法的特异性强、敏感度高、重复性好,具有较好的实用性,能准确定量DNA样品中靶基因的拷贝数,适合于对临床样品中胞内劳森菌定性、定量检测和防治效果的评价。

鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL^1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。

猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中5′端非编码区的靶序列设计了用于TaqMan荧光定量PCR的1对引物及TaqMan探针,以猪瘟活疫苗病毒为模板,在常规PCR的基础上优化了TaqMan荧光定量PCR反应条件,建立了猪瘟病毒(CSFV)TaqMan荧光定量PCR检测方法。其敏感性和特异性试验结果表明,所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法对CSFV具有很高的特异性,其检测灵敏度可达5.03×10-2μg/μL。说明TaqMan荧光定量PCR适用于CSFV的快速检测。

屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的研究

目的建立屎肠球菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。方法根据屎肠球菌的ddl基因设计TaqMan荧光定量PCR特异的引物及探针,在多种常见致病菌及条件致病菌中检测其特异性;将目的基因克隆到pMD18-T载体中建立标准曲线,检测方法的灵敏度和稳定性;使用腹水模拟标本验证方法的应用性。结果在特异性评价中,除了阳性对照外其余菌株均未见特异性扩增曲线。建立屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线,确定本方法对质粒标准品的检测下限为20copy/管。通过对1.0×107、1.0×105和1.0×1033个浓度质粒标准品的重复检测,确定屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR方法的组内变异系数为1.90%～3.91%;组间变异系数为1.52%～1.69%。应用屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR方法对含菌量为1.6×100～1.6×108cfu/mL浓度梯度的腹水模拟标本进行检测,其检测灵敏度为1.6×102cfu/mL。结论本研究建立了屎肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。

蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中幼虫芽孢杆菌16S r RNA基因保守序列设计特异性引物和探针,经反应体系及条件优化,建立了检测P.larvae Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:该方法与其它病原无交叉反应;最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏度高100倍;重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3%。应用该方法对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析。

新型鹅呼肠孤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

2020年以来,在我国养鹅地区出现了一种由新型鹅呼肠孤病毒(Novel goose reovirus,NGRV)引起的以肝脾点状白色灶性坏死为主要病变特征的鹅传染性疾病。为了快速有效地检测NGRV,本试验针对禽呼肠孤病毒的λC基因设计引物和探针,建立了基于TaqMan探针荧光定量PCR方法,结果显示:该方法特异性强,对鹅细小病毒、坦布苏病毒、鹅圆环病毒、番鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒和鹅星状病毒等病原不存在交叉反应;该方法具有较高的敏感性,最低可检测限为56.6拷贝/μL,比常规PCR方法敏感10倍;该方法的重复性良好,组内和组间变异系数小于2%。对37份疑似新型鹅呼肠孤病毒病的临床样品检测结果显示,荧光定量RT-PCR和RT-PCR检测出阳性样品均为13份,两者符合率为100%。测序结果表明,13份阳性样品均为NGRV。本试验成功建立了NGRV TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,为新型鹅呼肠孤病毒病的流行病学调查和防控奠定了坚实的基础。

同时检测PRRSV美洲型经典株、变异株和TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、变异株及弱毒活疫苗TJM-F92株的基因序列差异,设计了2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,与猪其他常见病毒无交叉反应;经典株、变异株、TJM-F92疫苗株重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。此外,该方法对324份疑似PPRSV感染的临床样品进行检测,结果显示PRRSV阳性114份,其中美洲型变异株105份、经典株6份、TJM-F92疫苗株3份,变异株和经典株混合感染4份。本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可以为PRRSV美洲型野毒株、疫苗株的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。

TaqMan荧光定量PCR监测野猪乙型脑炎病毒

为了更有效地保护野猪资源,评估其作为种质资源的安全性及人类驯养的风险性,采用Taq Man荧光定量PCR监测野猪乙型脑炎病毒的携带情况。结果显示,Taq Man荧光定量PCR敏感性是常规PCR检测方法的100倍,检测时间缩短了1/2。重复性试验中,批内及批间变异系数均低于2%。对40份家养野猪血液样品进行检测,Taq Man荧光定量PCR的阳性检出率为10%,国标(GB/T 22333-2008)中RT-PCR的阳性检出率为5%,灵敏度显著提高。表明该方法可用于野猪乙型脑炎的实时监测和流行病学调查,同时也为野猪群乙型脑炎的净化奠定基础。