鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。

基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10^(-3)fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10^(-2)fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

贵州蓝莓蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

该研究利用TaqMan特异性探针实时荧光PCR检测手段,建立了高效、精准鉴别贵州特色(中蜂)蓝莓蜜的方法。对贵州白竹林、麻卡和乌卡坪三个地域的蓝莓种植区蓝莓蜜进行采集(包括意蜂蓝莓蜜),同时购买市售蜂蜜及加拿大蓝莓蜜,该方法通过采集贵州麻江县白竹林地区蓝莓种植园及蜂场周围蓝莓同花期26种植物样本,基于植物基因组中trnL基因序列的多序列比对,设计蓝莓trnL基因特异性引物,并进行TaqMan探针验证。结果表明,本研究设计的TaqMan探针特异性强,建立的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法能检测到蓝莓花粉DNA最低浓度为0.3 ng/μL;利用建立的方法对11种市售蜂蜜和贵州蓝莓蜜样本进行检测,发现贵州蓝莓蜜的Ct值为24~26,蓝莓花粉数在800~1700颗,其余蜂蜜Ct值在30以上,表明该方法能够有效实现贵州蓝莓蜜和其他蜂蜜的区分,具有良好的应用前景。

尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立

尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。

猪繁殖与呼吸综合征病毒2型TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的建立

为了准确、特异、高效地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒2型(PRRSV2),本研究根据GenBank上登录的PRRSV2不同谱系流行毒株的ORF6基因序列,选取保守区域设计合成了1对特异性检测引物和1条MGB探针,经优化退火温度、引物和探针比例等反应条件及敏感性、特异性、重复性试验,建立了检测PRRSV2的TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果:以猪繁殖与呼吸综合征病毒1型(PRRSV1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪细小病毒(PPV)等阳性核酸为模板,均无扩增;对标准质粒的最低检测下限为1×10^(1)copies/μL,建立的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数R2为0.994;稳定性和重复性好,批内和批间变异系数均小于1.78%。应用该方法对保留的30份临床阳性样品进行检测,结果阳性100%,Ct值在22~36间。综上,本研究建立的TaqMan MGB荧光定量PCR方法可用于临床和实验室中PRRSV2的快速检测,为猪繁殖与呼吸综合征的防控提供了技术支持。

滩湖杂羊多胎基因(FecB)TaqMan探针SNP分型的研究

研究绵羊多胎基因FecB在滩湖杂羊群体中的多态性,可辅助开展滩羊多胎新品种(系)的培育工作。该试验利用TaqMan探针对滩湖杂羊G0、G1和G2代242份样品进行,通过对FecB基因的SNP进行分型,研究FecB基因在滩羊和湖羊杂交后代种群中的多态性及遗传规律。FecB基因来源于骨形态发生蛋白受体1B(bone morphogenetic protein receptor type 1B,BMPR1B),该基因外显子第746位A突变为G即为FecB。而FecB基因在滩湖杂羊群体中具有3种基因型,分别为BB型(突变型)、B+型与++型(野生型)。结果表明:G0代群体中BB、B+、++基因型频率分别为2.56%、14.10%和83.33%,B、+等位基因频率为9.62%和90.38%;G1代群体中BB、B+、++基因型频率分别为28.17%、38.73%和33.10%;B、+等位基因频率为47.54%和52.46%;G2代群体中BB、B+、++基因型频率分别为18.18%、54.54%和27.27%,B、+等位基因频率分别为45.45%、54.54%。可见,FecB基因可作为滩羊多胎品系选育的分子标记,选留带B基因的公母羊进行繁殖,可显著改善滩湖杂交羊群体中FecB基因的基因型结构和基因频率,提高群体的产羔数,加快滩羊高繁品种(系)的建立。

CT联合TaqMan探针法对不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的诊断价值

目的:探讨计算机断层成像(CT)联合Taq Man探针法对不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的诊断价值。方法:收集2020年3月至2023年3月石家庄市妇幼保健院收治的80例支原体肺炎患儿的病历资料,依据患儿年龄分为<1岁组(29例)、1~3岁组(23例)和>3岁组(28例);根据入院病程不同分为长病程组(43例,病程>7 d)和短病程组(37例,病程≤7 d)。对所有支原体肺炎患儿均进行CT联合TaqMan探针法检测心肺损伤情况,分析不同年龄组和病程组患儿的心肺损害发生率。采用CT和Taq Man探针检测胸腔积液、心肌厚度、心胸比、支原体核酸表达水平相关指标,采用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分析CT和探针检测支原体肺炎患者心肺损害的诊断价值。结果:CT成像显示,80例患儿中诊断准确率为93.75%(75/80),其中62.5%(50/80)的患儿存在典型的肺部异常。主要为肺部磨玻璃结节(GGO)、合并细菌性肺炎和网状。在小部分患儿中发现了支气管扩张。肺部异常患儿发现双侧肺部受累,其中下叶受累最明显。在临床上怀疑偶发性肺栓塞(PE)的38名患儿,进行了额外的造影剂CT,检测到24例患儿偶发性PE,诊断准确率为63.15%(24/38);采用TaqMan探针法检测支原体感染,建立了高灵敏度和宽动态范围的检测系统,在0.2~0.2×10^(-5)之间进行6次10倍稀释。在1 ng/μl微生物群落(MMC)-DNA标准品中制备,6次log10稀释度的高线性动态范围,回归系数为R^(2)=1。发现DNA检测下限为2×10-15g/μl;不同年龄支原体肺炎患儿随着年龄的增加,心肺损害发生率逐渐降低;<1岁组、1~3岁组和>3岁组支原体肺炎患儿心肺损害发生率分别为93.10%、73.91%和21.43%,3组比较差异有统计学意义(x^(2)=7.660、33.019,P<0.05)。长病程组心肺损害发生率(93.02%)明显高于短病程组(27.03%),差异有统计学意义(x^(2)=12.070、36.960,P<0.05)。心肺损害组患儿的胸腔积液量明显高于非心肺损害组,同时心肺损害组的心肌厚度显著增加,心胸比也显著高于非心肺损害组,以及支原体核酸表达水平比较差异具有统计学意义(t=9.52、3.33、4.22、10.00,P<0.05)。ROC曲线分析显示,CT联合TaqMan探针法诊断不同临床特征支原体肺炎患儿心肺损害的AUC均>0.5,且联合诊断的AUC最大。结论:CT联合TaqMan探针法对支原体肺炎患儿的心肺损害具有较高的诊断价值。对于支原体肺炎临床症状持续存在的患儿,应考虑进行心肺损害诊断。改编现有的TaqMan探针法,进一步扩展dPCR检测组合,将改进微生物诊断工具箱,并为支原体肺炎患儿心肺损伤的治疗决策提供可靠的定量数据。

多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162

为对转基因玉米MIR162的进口实行监测、规范转基因玉米在国内市场中的流通,建立一种转基因玉米MIR162准确快速的检测方法,通过设计转基因玉米MIR162品系特异性序列的引物和探针,摸索和优化多重荧光PCR体系和参数,开发建立多重实时荧光PCR TaqMan-MGB杂交探针标记法快速鉴定转基因玉米MIR162。结果表明,转基因玉米MIR162品系标准品和平行样品中内标基因和品系特异性基因均出现明显扩增曲线,其他转基因玉米品系标准品仅内标基因有扩增曲线,空白对照无扩增曲线,说明该TaqMan-MGB探针对转基因玉米MIR162品系具有扩增特异性。该方法可作为鉴定筛查转基因玉米MIR162品系及其转化体成分的有效方法,用于规范管理转基因产品在市场上的流通。

toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌

以toxR基因为靶基因,通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。特异性试验表明,该方法能选择性检测副溶血弧菌,而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;灵敏度试验表明,该方法最少可检测到25个拷贝的toxR基因重组质粒,对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;重复性试验表明,同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;所制作的标准曲线在2.5×101～2.5×106拷贝数之间有较好的线性关系,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析。结果表明,本研究所建立的副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,能进行定量检测,而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3 h,是快速检测副溶血弧菌的有效手段。

ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌,传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析,选取相对保守且高度特异的DNA序列,设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,对比现有的检测方法,以ETA基因为靶基因,基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点,具有很好的研究价值和应用前景。

TaqMan探针用于转基因食品的荧光定量PCR检测

选择了内源基因大豆植物凝集素 (lectin)、玉米转化酶 (invertase)和外源基因抗草甘膦除草剂的 5 烯醇式丙酮酰莽草酸 3 磷酸合成酶 (cp4epsps)、抗欧洲玉米螟的苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 (cryIAb)的TaqMan探针 ,确定了探针浓度和镁离子浓度等反应条件 ,分别对转基因大豆和转基因玉米系列标准品进行内源基因和外源基因的荧光PCR扩增 ,在PCR反应过程中分别以TET和FAM两种荧光通道信号分别追踪同一样品DNA的内源基因和外源基因的扩增动力学变化 ,并依此绘制了ΔCt值与转基因食品百分比含量之间的标准曲线 ,建立了转基因大豆和转基因玉米的TaqMan -荧光定量PCR检测方法 ,该方法具有探针设计较简便、成本较低的特点 ,初步实现了对转基因食品的定量分析及品种鉴定。

VDR基因多态性与宫颈病变及HPV感染转归的相关性

目的 分析维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)基因多态性与宫颈病变的关系,并探讨其对高危型人乳头瘤病毒(high risk-human papillomavirus, HR-HPV)感染转归的影响。方法 选取2020年9月至2021年10月于山西医科大学第二医院行阴道镜检查的患者376例,将病理结果示慢性宫颈炎和宫颈上皮内瘤变Ⅰ级者设为对照组(188例),宫颈上皮内瘤变Ⅱ级及以上者(CINⅡ+)为病例组(188例)。收集患者外周静脉血行VDR基因多态性检测,包括FOKI、BsmL、Apal和Taql的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点,分析VDR基因多态性与宫颈病变的关系。对选择行宫颈锥形切除术进行治疗的142例CINⅡ-Ⅲ级患者的HPV转归情况进行6个月的随访,根据随访结果分为HPV转阴者和同一型别HPV持续感染者,即转阴组和持续感染组,分析VDR基因多态性是否影响HPV感染的转归。结果 随访结果显示,104例患者的HPV感染呈转阴状态,33例患者持续感染同一型别的HPV,而另外5例患者则感染了其他型别的HPV。VDR基因多态性检测结果表明,FOKI SNPs ff基因型及f等位基因与CINⅡ+发生显著相关(P<0.05),并且与HR-HPV持续感染相关(P<0.05);TaqI SNPs tt及Tt基因型均增加CINⅡ+发生的风险(P<0.05),t等位基因与CINⅡ+发生风险增加有关(P<0.05),但与HPV持续感染未见相关性(P>0.05)。结论 VDR基因多态性与宫颈病变及HR-HPV感染转归相关,其中FOKI SNPs ff基因型及f等位基因和TaqI SNPs tt、Tt基因型及t等位基因与宫颈病变的发生存在关联,并且FOKI SNPs ff基因型及f等位基因可能影响HR-HPV感染的转归结果。

玉米细菌性枯萎病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR

为给农业和植物检疫部门提供一种特异性强、灵敏度高,可以快速、直接检测植物病原菌的方法,将玉米细菌性枯萎病菌16SrDNA基因克隆测序,根据该细菌与其他细菌菌株16SrDNA序列差异,设计出对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定点突变的特异性探针,除泛菌属3个种和欧氏菌属3个种外,还对假单胞菌属1个种,黄单胞菌属1个种,棒形杆菌属1个种,短小杆菌属1个种以及5种植原体进行了实时荧光PCR检测.结果表明:只有玉米细菌性枯萎病菌产生荧光,其他细菌和植原体都没有荧光产生.检测的灵敏度为104CFU/mL的菌悬浮液,相当于4个细菌细胞的基因,灵敏度高,也就是说,反应体系中只要有2个活细菌,实时荧光PCR就能检测到.相对灵敏度为107CFU/mL,而且整个检测过程只需2h,由于实验采用独特全封闭反应管及光电传导系统,不用凝胶电泳,降低了污染.

ARMS技术联合Taqman探针检测100例非小细胞肺癌EGFR基因突变

背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是决定表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)疗效最重要的预测因子,对EGFR基因突变进行检测,对指导患者个体化治疗具有重要意义。EGFR基因突变检测方法有很多,每种方法各有优缺点,本研究拟采用扩增阻滞突变系统(ampli cation refractory mutation system,ARMS)技术与Taqman探针相结合的方法,建立一种能快速、敏感及特异检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的方法。方法首先,应用Primer Premier5.0软件在EGFR基因E746_A750和L858R处设计ARMS引物及Taqman水解探针。然后,以包含E746_A750缺失和L858R点突变的质粒为研究对象,进一步分析所建立方法的灵敏度、敏感性以及特异性。最后,用所建立的ARMS-Taqman法检测100例非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)临床标本。结果在无背景DNA干扰的情况下,ARMS-Taqman法检测灵敏度可达10copies。对于检测敏感性,在500copies/L野生型基因背景下,其敏感性达1%;在5,000copies/l野生型基因背景下,其敏感性高达0.1%-0.5%。对于检测特异性,以正常人白细胞DNA为研究对象,21L858R突变存在一定程度的非特异性扩增,但其最小Ct高达14.89,而19Del未见非特异性扩增。对100份临床标本进行检测,19Del21例,21L858R18例,总突变率为39.0%。结论我们所构建的ARMS-Taqman法是一种快速、简便以及具有较高灵敏度和特异性的EGFR基因突变检测方法,值得在临床上进一步推广和验证。

TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因拷贝数的差异分析

探讨TaqMan探针与SYBR Green实时定量PCR 2种方法检测转基因植物外源基因的拷贝数方法的差异。以12株T0转基因水稻为材料,分别用TaqMan与SYBR Green实时定量PCR法检测其拷贝数,然后用SAS 9.1软件对2种方法的结果进行t检验分析。通过SAS对2组数据的t检验分析,在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green与TaqMan探针法的结果接近,差异不显著;当内参基因与目的基因扩增效率差异明显时,SYBR Green与TaqMan探针法差异显著。在内参基因扩增效率与目的基因扩增效率接近时,SYBR Green法测定转基因植物外源基因的拷贝数时结果接近TaqMan探针法。

运用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测AKAP10基因2073A/G单核苷酸多态性

目的建立一套以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的单核苷酸多态性（SNP）检测平台，并用于AKAPIO基因2073A／GSNP的检测。方法设计一对TaqMan探针加入到PCR反应系统中，并设立阴阳对照，对AKAPIO基因2073A／GSNP进行分型。同时验证部分样本PCR产物的直接测序结果。结果运用TaqMan探针实时荧光PCR技术对AKAPIO基因2073A／GSNP检测结果准确，与PCR产物的直接测序结果完全一致。AKAPIO基因2073A／G多态性分布与性别年龄无关（P〉0．05）。非条件logistic回归分析提示，AKAP10基因2073A／G突变型（AG＋GG）与野生型AA相比增加结直肠癌的发生风险（OR=1．52，95％CI：1．07～2．15。P=0．019）。结论通过合理设计TaqMan探针，设立阴阳性对照，应用TaqMan探针实时荧光PCR技术成功建立起一套SNP检测平台。AKAP10基因2073A／G多态性与结直肠癌发病存在显著相关性。

TaqMan-分子灯标:一种新型的荧光基因检测探针

在TaqMan及分子灯标的基础上开发了一类新型的均相荧光检测探针———TaqMan 分子灯标 (TaqMan MB) ,该探针集合了分子灯标的发夹结构及TaqMan探针降解作用的工作原理 ,使检测效果更好 .与实时PCR仪联用 ,可用于靶基因的定量检测 .

NIDD基因TaqMan探针的制备及其在实时荧光定量PCR方法中的应用

目的:制备NIDD基因TaqM an探针建立检测NIDD基因荧光定量PCR(FQ-PCR),以进一步研究NIDD的表达情况。方法:采用RT-PCR法,从出生后一天的SD大鼠脑组织mRNA中扩增NIDD基因的部分编码序列区(CDS)片段,克隆入pGEM-T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定。采用TaqM an探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果:RT-PCR法扩增出一特异产物与预期长度112 bp相符,DNA序列测序的结果与GeneBank提供的已知序列(AB098078)比较,所克隆的NIDD基因片段与其中的112 bp完全相同,与NIDD基因100%同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0.99,反应效率显示为1,各点变异系数小于10%。结论:采用RT-PCR和T载体技术成功制备出可应用于FQ-PCR的NIDD基因TaqM an探针。

用Taqman MGB探针研究中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性

目的了解中国人群肿瘤坏死因子α(thetumournecrosisfactorα,TNF-α)基因启动子区多态性。方法随机选取20名深圳地区汉族健康体检者,采用两对引物PCR扩增TNF-α基因启动子区(-1389nt～+125nt),对PCR产物进行序列分析,寻找单核苷酸多态性位点(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)。采用TaqmanMGB探针建立了-857nt(C/T)位点的实时定量PCR(thereal-timePCR)分型方法,并对中国汉族、壮族、布依族,水族及苗族群体共1108份样本进行了基因分型。结果在启动子区(-1322nt～+67nt),发现6个SNP位点,即-885(A/G)、-863(C/A)、-646(G/A)、-648(G/A)、-568(G/C)和-857(C/T),其中位点-646nt(G→A)为新发现SNP。-885、-648及-568nt位点碱基虽然与Genbank不同,但测序的20个个体基因分型相同。中国人群-857nt(C/T)位点基因型频率分别为0.79(CC),0.19(CT)和0.02(TT),中国汉族、壮族、布依族,水族及苗族群体间无显著性差异。中国人群-857T等位基因频率为0.116,与文献报道的韩国人群相同,但比日本人群低。结论中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性可能较保守。采用TaqmanMGB探针实时定量PCR技术对SNPs进行基因分型简便、快速及准确,易于自动化,为大规模的疾病相关性研究提供了有效的工具。