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基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析
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作者 江锦秀 张靖鹏 +3 位作者 林裕胜 刘维巍 胡奇林 万春和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1684-1695,共12页
热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实... 热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 HSP70基因 taqman实时荧光定量PCR方法 序列分析
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猪源盖塔病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:2
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作者 王娟 王帅勇 +9 位作者 虞凌雪 张毅峰 严杰聪 王曼茱 周艳君 单同领 童武 郑浩 童光志 于海 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第3期120-126,共7页
猪盖塔病毒感染是由盖塔病毒(GETV)引起母猪妊娠初期胎儿死亡、初生仔猪发病的一种繁殖障碍性疾病。猪是自然界中GETV的主要扩增宿主,可以产生足够高的病毒血症滴度来感染叮咬的蚊子并维持GETV的传播周期,所以定期对猪群进行GETV监测对... 猪盖塔病毒感染是由盖塔病毒(GETV)引起母猪妊娠初期胎儿死亡、初生仔猪发病的一种繁殖障碍性疾病。猪是自然界中GETV的主要扩增宿主,可以产生足够高的病毒血症滴度来感染叮咬的蚊子并维持GETV的传播周期,所以定期对猪群进行GETV监测对于预防潜在的GETV暴发具有重要意义。本研究通过分析GETV E2蛋白基因特征,设计特异性引物和探针,条件优化后建立检测GETV感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:以阳性质粒为标准品建立的标准曲线在1×10^(2)~1×10^(7)copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为1.61;该检测方法的最低检出限低至3.16 TCID50/mL,远远低于普通PCR的检测限3.16×10^(3)TCID50/mL;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的方法能够快速有效的检测和定量GETV,为猪群中GETV监测提供可靠的检测方法。 展开更多
关键词 猪源盖塔病毒 taqman实时荧光定量PCR方法 检测
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猪圆环病毒2型和3型检测方法建立及初步应用 被引量:2
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作者 李桐 赵润泽 +5 位作者 李博天 李春琪 王妍 郭利伟 杨小林 刘国平 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期151-159,共9页
为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别PCV2、PCV3与其他猪病... 为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示:该方法特异性好,可鉴别PCV2、PCV3与其他猪病病毒;PCV2最低检测下限为1.00×10^(1)copies/μL,PCV3最低检测下限为1.00×10^(0)copies/μL;重复性高,批内、批间的变异系数分别为0.01%~0.02%和0.02%~0.05%;本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份,PCV2样品符合率为97.47%,PCV3样品符合率为96.85%;测序结果显示,PCV2均为2d亚型,PCV3均为3c亚型。结果表明,建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确,节约成本,可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。 展开更多
关键词 PCV2 PCV3 双重taqman qPCR方法建立 混合感染
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猪圆环病毒3型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 陈如敬 吴学敏 +4 位作者 陈秋勇 车勇良 王隆柏 严山 周伦江 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期739-745,共7页
【目的】建立检测猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】通过分析明确PCV3复制相关蛋白Rep基因特征,设计针对Rep基因的特异性引物和探针,经条件优化后建立检测PCV3感染的TaqMan实时荧光定... 【目的】建立检测猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】通过分析明确PCV3复制相关蛋白Rep基因特征,设计针对Rep基因的特异性引物和探针,经条件优化后建立检测PCV3感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【结果】建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法敏感性好,最低检测限为42.2拷贝·μL-1;特异性强,对常见猪群传染病均无交叉反应;重复性好,组内变异系数和组间变异系数均在1.48%以内。对福建省2014年至2018年保存的193份组织样品进行检测发现,PCV3在福建省猪群中存在较高的阳性感染率(65.80%),且和PCV2混合感染率较高(52.85%)。【结论】本方法的建立为开展Rep基因在PCV3复制和感染过程中的作用机制提供检测方法。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 Rep基因 taqman实时荧光定量PCR方法 检测
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BVDV 1型和2型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:5
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作者 麻宝艺 盛陈艳 +6 位作者 刘宏莹 马青霞 汪婷婷 李健明 时坤 杜锐 冷雪 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第6期2326-2335,共10页
【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件... 【目的】建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)和2型(BVDV2)的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank上收录的95株BVDV1和BVDV25′-非编码区设计特异性引物,构建含有BVDV1和BVDV2目的片段的阳性质粒,优化反应条件,构建标准曲线,进行双重实时荧光定量PCR方法的特异性、敏感性和重复性检测,并利用建立的实时荧光定量PCR检测方法对采自吉林省的临床样品进行检测。【结果】建立的双重实时荧光定量PCR方法最适退火温度为57.0℃,最适引物浓度为0.5μmol/L,最适探针浓度为0.3μmol/L,BVDV1和BVDV2型的标准曲线分别为:Y=-3.54X+37.36(R^(2)=0.990)和Y=-3.18X+35.95(R^(2)=0.997)。对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)均无特异性扩增,批内和批间变异系数均<3%,检测下限为10拷贝/μL。临床样品检测结果显示,总体阳性率为23.1%(36/156),其中BVDV1阳性率为17.9%(28/156),BVDV2阳性率为5.1%(8/156)。【结论】本研究建立了可同时快速、准确鉴别BVDV1和BVDV2的TaqMan双重实时荧光定量PCR方法,为BVDV的防控与净化提供技术支撑。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒(BVDV) taqman实时荧光定量PCR方法 探针
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鼠痘病毒FQ-PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:1
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作者 王莎莎 付瑞 +1 位作者 王吉 岳秉飞 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2021年第1期101-105,共5页
目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样... 目的建立鼠痘病毒(ECTV)的Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法,并对实验室保存的裸鼹鼠组织样本、小鼠组织样本以及黄鼠组织样本进行检测。方法根据Gen Bank中鼠痘病毒的crm D基因序列设计引物探针,建立ECTV的FQ-PCR检测方法,对保存的样本进行筛查,并对部分阳性样本进行测序鉴定。结果建立的ECTV FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强,最低能检测到ECTV核酸浓度为10 copies/μL的样本,方法的标准曲线相关参数符合标准。使用该方法检测实验室63份裸鼹鼠脾组织样本和22份小鼠脾组织样本,结果全为阴性,检测4只黄鼠组织样本,结果阳性率为50%。阳性样本进行PCR检测后测序比对为ECTV核酸序列。结论经验证,建立的ECTV FQ-PCR检测方法能够灵敏特异的对样本中的ECTV进行筛查,实验室小鼠的日常监测不应忽视ECTV污染的潜在风险。 展开更多
关键词 鼠痘病毒 taqman探针法荧光定量PCR方法 裸鼹鼠 黄鼠
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猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:3
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作者 骆辉 阴文奇 +5 位作者 高露茜 王雪涛 罗旭 廖果 李书伟 周远成 《四川畜牧兽医》 2021年第5期30-32,35,共4页
为建立一种快速、特异、灵敏的猪圆环病毒3型(PCV3)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针,通过对反应体系和扩增条件进行优化,建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR... 为建立一种快速、特异、灵敏的猪圆环病毒3型(PCV3)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针,通过对反应体系和扩增条件进行优化,建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法。该方法对7.87×10^(3)~7.87×10^(9)拷贝/μL的PCV3标准质粒呈现良好的线性关系,最低检出浓度为7.87×10^(1)拷贝/μL,比常规PCR的灵敏度高100倍。与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒均无交叉反应,具有良好的特异性。不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验结果均显示变异系数(CV)小于1%,重复性较好。对2018~2020年从四川省不同地区收集的329份正常猪血清及187份疑似PCV阳性临床样品进行检测,得出PCV3阳性率分别为31.3%和38.5%,流行率较高。上述结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测PCV3,为PCV3的临床检测及流行病学调查奠定了基础。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 taqman荧光定量PCR方法 检测
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Taqman PCR-based Methods for Rapid Detection of Salmonella in Pet Food 被引量:1
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作者 JIA Jun-tao CUI He +3 位作者 MA Yun ZENG Jing JIANG Ying-hui LI Zheng-yi 《Chinese Food Science》 2012年第3期32-34,共3页
[ Objective] To establish a Taqman real-time PCR for detection of Salmonella in pet food. [Method] A pair of primers and a probe were designed based on published nucleotide sequence of invA gene encoding the invasion ... [ Objective] To establish a Taqman real-time PCR for detection of Salmonella in pet food. [Method] A pair of primers and a probe were designed based on published nucleotide sequence of invA gene encoding the invasion protein of Salmonella enterica. [ Result] The assay detects Salmonella specifically. The detection limit of the real-time PCR was 17 CFU/test (25 uL/test) for the positive strain. This method was effective to detect artificially contaminated pet food. [ Conclusion] The results showed that Taqman PCR assay was rapid and accurate for detection of Salmonella from infected pet food. 展开更多
关键词 Fluorescence quantitative PCR SALMONELLA taqman probe DETECTION China
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基因编辑产品检测技术研究进展 被引量:4
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作者 王梦雨 王颢潜 +1 位作者 王旭静 王志兴 《生物技术进展》 2021年第4期438-445,共8页
当前国内外生物技术产业革命加速推进,以基因编辑为代表的转基因新技术发展迅猛,新基因、新性状、新产品不断涌现。围绕基因编辑产品的检测方法将成为转基因生物安全监管的重要一环和有效支撑。因此,基于测序技术、酶切技术、PCR技术和... 当前国内外生物技术产业革命加速推进,以基因编辑为代表的转基因新技术发展迅猛,新基因、新性状、新产品不断涌现。围绕基因编辑产品的检测方法将成为转基因生物安全监管的重要一环和有效支撑。因此,基于测序技术、酶切技术、PCR技术和其他检测技术4个方面,总结了目前应用于基因编辑产品检测的一些技术方法,并对每种方法的优缺点进行了分析,以期为今后基因编辑产品的检测提供思路,做好转基因监管技术储备。 展开更多
关键词 基因编辑 检测技术 下一代测序 taqman方法
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三文鱼鱼松中大西洋鲑鱼成分荧光定量PCR检测方法的建立 被引量:1
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作者 屈菲 王秋艳 +2 位作者 赵大千 洪滨 万超 《中国口岸科学技术》 2022年第4期61-66,共6页
本文主要通过建立荧光PCR法实现高效鉴别大西洋鲑鱼成分的目的。以鲑形目8种鱼类的COⅠ基因序列作为目标基因来与大西洋鲑鱼基因作比对,以差异序列作为其特异性引物,对鉴定大西洋鲑鱼源性成分的方法——荧光定量PCR法进行建立与完善。... 本文主要通过建立荧光PCR法实现高效鉴别大西洋鲑鱼成分的目的。以鲑形目8种鱼类的COⅠ基因序列作为目标基因来与大西洋鲑鱼基因作比对,以差异序列作为其特异性引物,对鉴定大西洋鲑鱼源性成分的方法——荧光定量PCR法进行建立与完善。实验选用同目的 6种近源物种和45种非近源物种进行特异性检验,能够对大西洋鲑鱼源性成分的特异性进行有效识别,且具有较高灵敏度,仅0.1 ng/μL大西洋鲑鱼DNA即可被检出。实验对市售的5种鱼松,共计32个受测样本进行有效检测,证实此方法对鱼松中的大西洋鲑鱼成分鉴别具有较高的灵敏度和特异性,可广泛应用于鱼松中大西洋鲑鱼源性成分的识别与鉴定。 展开更多
关键词 大西洋鲑鱼 三文鱼 基于taqman方法的荧光实时定量PCR 源性成分
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北京地区CYP450药物代谢基因多态性抽样统计研究 被引量:1
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作者 沈俊辉 刘仁权 +3 位作者 马星光 陈建新 黄春芳 余学杰 《中国预防医学杂志》 CAS 2011年第2期155-157,共3页
目的调查北京地区的药物代谢酶系CYP450相关的基因型分布情况,为北京地区的个性化用药指导提供建议。方法本文涉及的研究通过在北京地区抽样使用Taqman方法进行了CYP450相关的基因型检测,估算出了在北京地区5个CYP基因中的6个SNP位点的... 目的调查北京地区的药物代谢酶系CYP450相关的基因型分布情况,为北京地区的个性化用药指导提供建议。方法本文涉及的研究通过在北京地区抽样使用Taqman方法进行了CYP450相关的基因型检测,估算出了在北京地区5个CYP基因中的6个SNP位点的基因型的分布情况。结果其中,CYP2C19-b和CYP3A4两个基因中所检测的位点所对应的比重最小的基因型在北京市人口中的比重接近于0。本研究说明,CYP2D6和CYP2C19两个基因的基因型在北京市人口中呈现较高的多态性分布,医师在使用涉及到这两个基因参与代谢的药物时,可以参考CYP450基因型检测结果。结论建立针对我国不同地区的CYP450基因型数据库对于医疗卫生体系有重要作用。 展开更多
关键词 个性化用药 药物相互作用 CYP450 基因型 单碱基多态性(SNP) taqman方法
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