TaqManMGB探针实时荧光定量PCR用于中华按蚊kdr基因突变检测的研究

目的建立一种用于中华按蚊杀虫剂抗性相关kdr基因突变检测的实时荧光定量PCR方法。方法根据中华按蚊kdr基因序列及其L1014位点常见的突变类型设计一对引物和三条TaqMan MGB探针,对TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR反应体系和条件进行了优化,选择经测序鉴定后的6种中华按蚊kdr基因常见类型对该方法进行验证,并用该方法对50个实验室和113个现场中华按蚊样本进行检测。结果实时荧光定量PCR方法能对中华按蚊kdr基因6种不同的基因型进行检测,单管法可判断kdr基因L1014是否发生突变,双管法可对具体突变类型进一步鉴别。经检测,50个实验室样本均为野生型纯合体,而113个现场样本中,仅12个样本为野生型纯合体,其余101个样本均发生了L1014F或L1014C突变,突变频率为87.61%。结论TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR可用于中华按蚊kdr基因L1014位点突变的检测。

羊痘病毒属病毒多重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时快速鉴别检测羊痘病毒属病毒(CaPV)的方法,本研究设计了一对针对CaPV的通用引物和3条特异性的TaqMan MGB探针,并对其反应条件进行优化,建立了单管同时鉴别检测3种病毒的多重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该多重荧光定量PCR方法仅对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)有特异性扩增,而对牛痘病毒等其它相关病毒核酸无扩增。在10~2拷贝/μL～107拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;对LSDV、 GTPV、SPPV的最低检测限分别为14.8拷贝/μL、32.9拷贝/μL、26.7拷贝/μL。标准曲线相关系数(R2)均为0.999。批内及批间变异系数均小于1.5%。应用本研究建立的方法和OIE陆生动物手册推荐普通PCR方法分别对185份临床样品和67份模拟样品进行检测,该方法检出率比普通PCR方法高约1.6%。本研究建立的CaPV多重TaqMan-MGB荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便快速等优点,适用于CaPV临床样品的快速鉴别检测。

荧光定量PCR鉴别检测U·Urealyticum和U·Parvum方法的建立

目的:建立定量检测U.Urealyticum(UU)、U.Parvum(UP)的灵敏、特异的荧光定量PCR方法。方法:选择UU和UP的尿素酶基因设计两对引物和对应的探针组建2个TaqMan PCR反应体系,应用克隆的质粒建立系列标准品,作为模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验和特异性分析。结果:UU和UP两标准曲线具有良好的线性关系,相关系数分别为0.9895和0.9956,无非特异性扩增。结论:应用实时TaqMan PCR法定量检测UU、UP,具有快速、特异、灵敏、便捷的特点,为解脲脲原体感染的流行病学和病理机制的研究奠定了基础。

Taqman MGB荧光PCR检测生殖支原体

目的参照文献建立一种快速、灵敏、准确的生殖支原体（Mg）的检测方法，并应用该方法调查生殖支原体在广西贺州暗娼中的流行情况。方法参考文献中以生殖支原体Pa基因为靶基因设计的引物和Taqman MGB探针进行实时定量PCR，以生殖支原体标准菌株G37制备标准品，对广西贺州暗娼人群的宫颈拭子标本进行生殖支原体的检测。结果建立的Taqman MGB实时定量PCR方法检测的线性范围好（1×10—10^6拷贝／μl，R^2=0．993，重复性好，（批内变异系数=0．7％，批间变异系数：1．09％），敏感性高，检测限（LOD）为10拷贝／μl，定量限（LOQ）为50拷贝／μl。采用该方法检测404份拭子标本，生殖支原体的检出率为12．1％。结论针对生殖支原体Pa基因的TaqmanMGB实时PCR可以快速、灵敏地对生殖支原体进行定性及定量的检测。

应用Taqman MGB定量PCR技术建立HTLV-I前病毒的检测体系

建立了一种快速检测HTLV-I前病毒的荧光定量方法。利用HTLV前病毒DNA序列设计特异性TaqmanMGB探针及引物对目标DNA片段进行实时检测,用含目标片段质粒构建标准曲线。该定量检测方法在10^3~10^7copy/μL范围内与Ct值呈良好线性关系（R2可达0.999）,最低检测浓度为5copy/μL。利用该系统对献血者血液标本进行HTLV前病毒初筛确认及定量检测,结果表明该方法重复性良好,特异性高,适用于献血者和临床标本的检测和确认,亦可用于对HTLV病毒载量与成人T细胞白血病等疾病的关联性进行研究。