橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)小橡胶粒子蛋白基因的克隆与表达分析

以橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)为试材,在茉莉酸处理的根转录组数据分析的基础上,采用PCR的方法克隆获得小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein,SRPP)基因。通过生物信息学分析研究了该基因的特征,并检测了该基因的时空和原核表达情况。结果表明:SRPP3蛋白分子质量24.431 kDa,理论等电点(pI)4.64,属于酸性蛋白,二级结构以β-折叠为主,具有REF保守结构域,属于REF/SRPP家族成员之一。系统进化树分析显示TkSRPP3基因与短角蒲公英同源性最近;时空表达分析表明,TkSRPP3基因在六月龄的根中表达最高,推测该基因可能与天然橡胶的合成有关。TkSRPP3原核表达最佳诱导条件为浓度1 mmol·L^-1 IPTG诱导表达6 h。该研究为深入了解REF/SRPP家族中SRPP3在天然橡胶中的作用提供了参考依据。

青胶蒲公英根多酚超声辅助提取工艺优化及其体外抗氧化、降糖活性

以青胶蒲公英根为原料,选取液料比、超声功率、提取温度和提取时间作为试验因子,在单因素实验基础上,采用响应面法对青胶蒲公英根多酚超声辅助提取工艺进行优化,并对提取的青胶蒲公英根多酚的体外抗氧化及降糖活性进行了测定。结果表明:青胶蒲公英根多酚提取的最优条件为液料比33:1 mL/g,超声功率270 W,提取温度61℃,提取时间31 min,在此条件下青胶蒲公英根多酚得率为1.46%±0.03%。体外活性研究表明,青胶蒲公英根多酚提取物清除DPPH自由基和ABTS+自由基的半抑制浓度(IC_(50))分别为54.06和39.27μg/mL,对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC_(50)值分别为133.26和50.22μg/mL,这表明青胶蒲公英根多酚具有较强的体外抗氧化和降糖能力。本研究可为青胶蒲公英的综合开发利用提供理论依据。

盐胁迫对橡胶草生长及生理指标的影响

以橡胶草为试验材料,对不同程度盐胁迫处理(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%NaCl)橡胶草生长及生理指标进行了比较分析,探讨橡胶草在盐胁迫条件下的生长发育特性。结果表明:橡胶草生长、发育对盐胁迫反应较为敏感,不同水平盐胁迫处理条件下,橡胶草植株形态、生理指标差异显著。橡胶草对盐胁迫的耐受极值为NaCl浓度0.5%,超过极值盐浓度,则橡胶草植株无法存活。橡胶草盐害程度与盐胁迫处理时间呈正相关,0.2%盐胁迫处理浓度是进行橡胶草苗期耐盐性鉴定和筛选的较适宜浓度。

橡胶草法尼基焦磷酸合酶基因的克隆与功能分析

【目的】法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)是天然橡胶生物合成的甲羟戊酸途径中的关键酶,获得橡胶草FPS基因并转化野生橡胶草,为研究FPS基因在橡胶草橡胶生物合成过程中的调控作用奠定基础。【方法】采用同源克隆的方法获得橡胶草FPS基因全长c DNA序列,并对该基因进行生物信息学分析。对橡胶草和其他18种不同高等植物的FPS氨基酸序列进行多序列比对及进化树分析。提取橡胶草不同组织:根、叶柄、叶、花梗、花和种子RNA,对FPS基因进行组织特异性表达分析,并对不同生长时期的橡胶草FPS表达量进行比较,分析橡胶草生长过程中FPS的调节作用。将该基因在野生型橡胶草中过表达,对得到的转基因和野生型植株FPS相对表达水平进行分析,比较转基因和野生型植株橡胶含量的变化。碱煮法提取转基因和野生型橡胶草根部的橡胶,测定橡胶含量。【结果】获得橡胶草FPS基因全长c DNA序列,命名为TKFPS(Gen Bank登录号KJ558350.1)。序列分析表明该基因包含1个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为39.35 k D,理论等电点(p I)为5.41,平均疏水性为-0.242。多序列比对结果表明,橡胶草FPS氨基酸序列含有高等植物FPS基因的5个保守结构域,系统发育分析结果显示新疆野生橡胶草与蒲公英处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Target P亚细胞定位分析得知,TKFPS蛋白无跨膜区域,可能定位于细胞质中发挥功能。组织特异性分析结果表明TKFPS在橡胶草的根、叶柄、叶、花梗、花、种子中均有表达,其中,在叶中表达量最高,根次之,在花中表达量最低。重组子p CAMBIA2300-35S-TKFPS经农杆菌介导法转化野生橡胶草叶盘,得到6株转基因植株。实时荧光定量PCR检测发现,与野生型相比,转基因株系FPS的相对表达量水平明显升高,6株转基因株系TKFPS表达量平均约是野生型的2.8倍。橡胶含量测定结果表明6株转基因株系的根中橡胶质量分数平均比野生型增加了3.92%。【结论】成功从橡胶草中克隆获得TKFPS,并转化野生橡胶草得到转TKFPS的高产橡胶草株系,FPS在橡胶草产胶过程中发挥重要功能。

橡胶草胶乳蛋白双向电泳方法的建立

采用Tris饱和酚法和TCA/丙酮沉淀法提取橡胶草(Taraxacum Kok-saghyz Rodin)胶乳蛋白质,并建立蛋白双向电泳方法。结果表明,TCA/丙酮沉淀法得到的双向电泳图谱横条纹较多,背景模糊,得到约446个蛋白质点;Tris饱和酚法提取样品双向电泳的聚焦效果较好,图谱显示约630个蛋白点,其中包括较丰富的低分子量蛋白。

水分胁迫对3个不同地区橡胶草生理特性的影响

本研究以3个不同地理来源的橡胶草群体为研究对象,使用不同浓度的聚乙二醇(PEG-600)溶液分别对3个供试群体成员苗期进行模拟水分胁迫,测定了其叶片相对含水量、叶绿素含量、抗氧化保护酶活性、渗透调节物质含量、丙二醛含量、叶片长度、叶片宽度以及最大根长。结果表明,随着胁迫浓度的提高3个供试群体的叶片相对含水量、叶绿素含量、抗氧化保护酶活性以及生长发育指标呈下降趋势,渗透调节物质含量以及丙二醛含量呈上升趋势;综合各指标表明,3个供试橡胶草群体抗旱性表现为昭苏群体>石河子群体>临夏群体。

橡胶草顺式异戊烯基转移酶基因的克隆与原核表达

克隆新疆野生橡胶草顺式异戊烯转移酶基因,对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究该基因的功能和植物体内天然橡胶合成分子机制奠定基础。采用同源克隆法结合RT-PCR技术获得目的基因,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-30a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。结果表明:该基因开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸,推测的蛋白分子质量为34.9ku,理论等电点为8.74;具有cis-异戊烯基转移酶的5个高度保守区,属于cis-IPPS superfamily蛋白家族;系统进化树表明,橡胶草顺式异戊烯基转移酶与短角蒲公英的亲缘关系最近;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。可见,利用RT-PCR技术从橡胶草叶片中克隆得到顺式异戊烯转移酶基因,成功构建原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到表达。

遮荫对橡胶草生理特性的影响

【目的】研究不同遮荫处理对橡胶草光合性能和物质含量的影响,分析遮荫影响橡胶草的生理机制过程。【方法】以新疆当地2个橡胶草品系为材料,于2019年在新疆农业科学院安宁渠综合试验场进行大田试验。设不遮荫、轻度遮荫、重度遮荫3个处理。【结果】与正常光照相比,轻度遮荫促进了橡胶草根系和叶片中柠檬酸、苹果酸、丁二酸、草酸、总黄酮、总酚、绿原酸、咖啡酸等物质的合成,提高了橡胶草的代谢能力,进而增加了橡胶草光合性能和物质含量,最终影响了橡胶草的光合生理特性。重度遮荫造成橡胶草SPAD值、净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)迅速降低,但胞间CO2浓度(Ci)上升,橡胶草叶片和根系中的总酚、总黄酮、有机酸组分、绿原酸和咖啡酸含量均下降。昭苏1-1的相关指标变化幅度较哈引2-6小。【结论】不同品系橡胶草在不同遮荫环境下的生长适应性不同。尤其在重度遮荫环境下,2种橡胶草光合性能均显著下降,光合产物累积能力及输出能力受阻,最终影响橡胶草生理特性。

橡胶草高频再生体系的建立

以橡胶草叶片为外植体,研究了消毒时间、外源激素等因素对外植体成活率、不定芽的诱导、伸长和生根的影响。结果表明:用0.1%的升汞处理7min为最佳消毒方法,最佳的再生培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA,平均诱导率为97.3%,芽伸长培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+0.4mg/L GA3,生根培养基为1/2MS+0.2mg/L NAA,生根率为100%,所获得的组培苗生长健壮且移栽成活率高,最终摸索出了橡胶草最佳的再生体系。

GA_3对橡胶草生理特性及开花的影响

以橡胶草叶片为试材,喷施不同质量浓度[0 mg/L(CK)、50 mg/L(T1)、100 mg/L(T2)、150mg/L(T3)、200 mg/L(T4)、300 mg/L(T5)、600 mg/L(T6)]赤霉素(GA3),研究其对橡胶草叶片叶绿素含量、类胡萝卜素含量、酶活性、开花及主要开花性状的影响。结果表明:叶片喷施GA3后,随着时间的推移,各处理叶片叶绿素含量和类胡萝卜素含量整体上呈逐渐上升趋势,但上升幅度较小,且CK最高;GA3处理均使叶片SOD、POD、CAT活性下降,其中,T3的酶活性较其他处理低,T3叶片SOD活性在处理后10 d与CK相差最大,活性下降25.39%,活性最低峰时较CK下降11.81%;T3叶片CAT活性处理后10 d与CK相差最大,活性下降77.66%,活性最高峰时较CK下降44.00%;T3叶片POD活性在处理后20 d与CK相差最大,活性下降75.17%,处理后60 d与CK相差最小,POD活性下降32.13%。随着GA3质量浓度的增加,各处理营养生长期时间延长,开花推迟,花期缩短;花葶高度和花葶粗均呈现先升高后下降的趋势,开花数则呈下降趋势;而花直径差异不显著,但均与CK差异显著。综上,外施一定质量浓度的GA3对橡胶草花葶高、花葶粗、花直径生长均有一定的促进作用,且质量浓度为150 mg/L时促进效果最佳。

不同种植密度对橡胶草主要农艺性状及生物量的影响

为了明确橡胶草区域适应性栽培的合理种植密度,在大田条件下设置行距×株距分别为20 cm×20 cm、20 cm×30 cm、20 cm×40 cm、20 cm×50 cm、30 cm×20 cm、30 cm×30 cm、30 cm×40 cm、30 cm×50 cm共8个密度处理,研究不同种植密度对橡胶草现蕾期和结实期主要农艺性状和生物量的影响。结果表明:当行距为20 cm或30 cm时,橡胶草现蕾期和结实期主要农艺性状和生物量均随着株距增加呈增大趋势,且行距为30 cm时的主要农艺性状和生物量均比行距20 cm的高;此外,不同种植密度下橡胶草的叶长、株幅、千粒重、鲜根重、干根重和根粗差异均达到显著水平,而种植密度对花葶长度及花葶数量等影响较小,在行距×株距为30 cm×40 cm时,橡胶草的主要农艺性状和生物量较高,农艺性状也较好。因此,行距×株距为30 cm×40 cm是橡胶草区域适应性栽培较合适的种植密度。

茉莉酸甲酯对橡胶草生理生化及乳管分化的影响

为了研究喷施不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)对橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin,TKS)农艺性状和乳管分化相关生理生化指标的影响,分析这些指标的变化与乳管分化的关系,明确促进橡胶草乳管分化的最佳MeJA喷施浓度,本试验选择1个月生的盆栽橡胶草为材料,设5个浓度的MeJA处理水平,即0.25、0.50、1.00、2.00和5.00 mmol/L,以喷施含2.2%无水乙醇的蒸馏水处理的橡胶草为对照,研究喷施不同浓度MeJA对橡胶草农艺形状、叶片叶绿素含量、根系活力、根系内源激素含量、根系PAL活性、根系木质素含量及根部韧皮束圈数的影响。结果显示:与对照相比,喷施不同浓度MeJA可增加橡胶草的主根长度、主根粗度和根冠比,但抑制了叶片的生长。喷施不同浓度MeJA提高了叶片叶绿素含量和根系活力;橡胶草根系内源玉米素核甘(ZR)、生长素(IAA)和MeJA含量均呈增加趋势,且均大于对照处理;随着MeJA处理浓度的增大,脱落酸(ABA)和赤霉素(GA3)含量呈先增加后减小的趋势;6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)含量与对照无显著差异。适宜浓度MeJA可增加橡胶草根部苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,提高根系木质素含量,增加韧皮束圈数。经0.25、0.50和1.00 mmol/L MeJA处理后植株韧皮束圈数与对照呈显著差异,与对照相比分别增加了29.4%、35.3%和47.0%。喷施适宜浓度的MeJA可促进根部的生长,优化地上部与地下部的关系;加速根部IAA、MeJA、GA3、ZR和ABA代谢;提高植株PAL活性,增加木质素含量,提高乳管分化能力。因此,可以通过叶面喷施浓度为1.00 mmol/L的MeJA最大限度的促进橡胶草根部乳管分化。

不同温度处理对橡胶草种子发芽特性的影响

为明确橡胶草人工育苗合理播种期和播种技术,设置了不同温度梯度和冷热预处理,研究了其对橡胶草种子发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数的影响。结果表明：不同温度对橡胶草种子的发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数的影响显著,在5-35℃范围内,随温度的上升呈先增后减趋势,其中25℃时种子发芽率、发芽势、发芽指数及活力指数均达到最大值,分别为85%、79%、14.17及33.87,而且该温度下种子发芽所需时间较短,发芽速度最快;冷热预处理对橡胶草种子发芽率影响不显著,而对活力指数的影响显著,5℃处理8-20天或35℃处理6-18 h的种子活力指数显著高于对照。因此,橡胶草种子发芽最适温度为25℃,5℃处理8-20天或35℃处理6-18h有利于提高种子发芽特性。

利用酶标仪快速批量测定橡胶草中菊糖的含量

以橡胶草根为研究对象,采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS法),利用酶标仪为检测仪器,建立了橡胶草中菊糖的快速测定方法。结果表明,酶标仪检测橡胶草根中总糖和还原糖含量的最佳实验条件:波长为550 nm、DNS显色剂用量为0.8 m L、沸水浴显色时间为8 min。同时,获得此条件下回归方程为A=0.6872C-0.0215(R^2=0.9982),线性范围为0~2.2 mg/m L,加样回收率为96.67%~102.33%。该方法灵敏、稳定、重现性好,可在短时间内完成多个样品同时测定,该方法所得结果略高于分光光度计法。

氮磷钾不同施肥水平对橡胶草生长发育的影响

研究了N、P、K不同施肥水平对不同时期橡胶草主要农艺性状的影响,并对不同施肥水平下不同时期主要农艺性状进行相关性分析。结果表明,不同施肥处理对不同时期橡胶草的叶长、叶宽、叶形指数等指标的影响程度不同,且均显著高于对照(p<0.05)。其中,橡胶草植株在生长期时主要受N的影响,且生长速度较快;到现蕾期不仅受N的影响,开始逐渐受P的影响;在开花期和结实期时受P的影响最为显著,且生长速度相对缓慢,其中花葶长度和花葶数量受P影响最为显著,花序大小除了受P影响外,受K的影响也较为显著。叶长与叶宽、叶形指数、株幅、花葶长度、花葶数量、花序长度及花序宽度呈显著正相关;叶宽与叶形指数呈显著负相关,而与株幅、花葶长度、花葶数量呈显著正相关;株幅与花葶长度、花葶数量及花序宽度均呈显著的正相关;花葶长度与花葶数量和花序宽度均呈显著的正相关。

橡胶草的研究进展

对橡胶草的形态特征、生物特性、栽培技术,橡胶草的橡胶合成及提取等相关研究进行了综述,并对今后的研究方向作了简要的展望。

利用SSR标记分析橡胶草种质资源的遗传多样性

为了解橡胶草种质的遗传背景和遗传多样性,为今后橡胶草育种提供理论依据。本研究利用23对SSR引物对96份橡胶草材料进行遗传多样性分析。23对SSR引物通过扩增共得到71个等位变异,等位变异范围2-6个,平均等位基因数为3.09个。通过聚类分析,96份材料被分为2大类群,类群I包含所有俄罗斯和美国材料以及5份新疆野生材料,类群II包含其余新疆7个居群的材料;俄罗斯和美国材料同属于亚群A,平均遗传相似度为0.88,说明它们之间存在紧密的亲缘关系;新疆7个居群的材料被分为6个亚群,显示丰富的遗传多样性,而且相互之间存在复杂的遗传关系。本研究结果证明SSR标记能够有效地用于橡胶草的遗传多样性研究,并为今后的橡胶草种质收集和遗传育种提供了重要理论依据。

氨磺灵和秋水仙素诱导橡胶草四倍体效果的比较研究

为探讨不同诱变剂对橡胶草四倍体的诱导效果,以橡胶草幼芽为材料,采用浸芽法,比较分析氨磺灵和秋水仙素2种诱变剂不同浓度和处理时间对橡胶草多倍体的诱导效果及多倍体橡胶草的形态特征变化。结果表明:氨磺灵处理橡胶草的成苗率(60%~75%)和最高诱变率(14.08%)均高于秋水仙素处理(0~59%和5.56%),其嵌合体率(27.27%)低于秋水仙素处理(75.00%),其中0.04 mmol/L氨磺灵处理30 min,成苗率为71.00%,变异率14.08%,为最佳诱变条件。可见,氨磺灵比秋水仙素更适合用于橡胶草多倍体诱导。诱导后获得的四倍体橡胶草叶片厚度、气孔大小、花和种子大小均显著大于野生型二倍体植株,气孔密度则显著低于野生型植株,这些形态特征可辅助多倍体橡胶草快速筛选和鉴定。本研究初步探明了2种诱变剂对橡胶草染色体加倍的诱导效果,为今后橡胶草多倍体育种提供理论依据和技术支持。

不同溶液对橡胶草种子发芽能力的影响

[目的]研究以一定浓度赤霉素、聚乙二醇(PEG6000)和高锰酸钾渗透处理橡胶草种子对其萌发及相关生理指标的影响,分析橡胶草种子萌发和幼苗生长与水分胁迫的关系,旨在研究引发及促进供种萌发和活力的效应,为新能源植物橡胶草的生产管理提供科学依据。[方法]分别将橡胶草种子浸泡于50、100、150、200 mg/L的赤霉素,质量分数为1%、5%、10%、15%的聚乙二醇溶液,质量分数为0.01%、0.02%、0.05%、0.10%的高锰酸钾溶液,用去离子水作对照,统计发芽势,计算发芽指数和活力指数。[结果]不同溶液浸泡使橡胶草种子的发芽能力存在差异。当赤霉素浓度达到150 mg/L时,出现较高的发芽势和发芽率,发芽率为78%,发芽指数为21.22%;当聚乙二醇浓度为15%时,出现较高的发芽势和发芽率,发芽势为72%,发芽率为85%,发芽指数为22.08%;当高锰酸钾浓度为0.02%时,出现较高的发芽指数和发芽率,发芽势为50%,发芽率为84%,发芽指数为19.23%。[结论]3种处理方法中以聚乙二醇浓度为15%时,处理效果最好,发芽势为72%,发芽率为85%,发芽指数为22.08%,与CK相比差异极显著(P<0.01),建议推广使用。橡胶草发芽能力好,建议推广。

不同激素浓度对橡胶草不同器官直接分化再生苗的影响研究

分别以橡胶草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)叶片、叶柄、根段为外植体,以MS为基本培养基,比较不同激素浓度对橡胶草不同器官直接分化再生苗的影响。结果表明:橡胶草不同器官直接分化再生苗所需最佳激素浓度不同。(1)最适合诱导叶片和叶柄直接芽分化再生苗的激素浓度均为NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L,其芽分化率和每外植体平均芽数分别为36.44%、38.83个和95.83%、10.56个;(2)最适合诱导根段直接芽分化再生苗的激素浓度为NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L,其芽分化率和每外植体平均芽数分别为92.25%和21.49个。该研究为橡胶草高频再生体系的建立及进一步利用基因工程进行品种改良奠定了基础。