羊种布鲁氏菌Tat系统底物蛋白ErfK的抗原性和免疫原性研究

为分析羊种布鲁氏菌双精氨酸转运系统(twin-arginine translocation system,Tat system)毒力相关底物蛋白L,D-转肽酶ErfK诱导宿主产生的免疫应答情况,首先对布鲁氏菌M28毒株ErfK基因序列(WP_002963714.1)进行生物信息学分析,参考序列设计引物,构建表达载体pET-30a(+)-ErfK,经IPTG诱导表达、亲和层析和镍柱纯化获得目的蛋白;利用SDS-PAGE和Western blot对重组ErfK(rErfK)蛋白进行抗原性鉴定;将rErfK蛋白免疫小鼠,分别在免疫后15、30和45 d收集血清和脾脏,检测蛋白免疫后小鼠的细胞免疫应答和体液免疫应答情况。生物信息学预测结果显示,ErfK蛋白无跨膜结构,为亲水性蛋白,有多个T细胞和B细胞抗原表位;SDS-PAGE和Western blot均可获得25 kDa的蛋白条带,重组蛋白可与布鲁氏菌阳性血清发生反应,证明rErfK有良好的抗原性;小鼠免疫试验结果显示,rErfK组小鼠脾脏CD8^(+)T细胞含量相比PBS组显著上升(P<0.05),且脾脏Th1型细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4转录水平均显著上升(P<0.05),此外,rErfK免疫也能极显著诱导小鼠血清中总IgG和特异性IgG的产生(P<0.01)。上述结果表明,经大肠杆菌表达的布鲁氏菌rErfK蛋白可诱导小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。本研究为基于ErfK蛋白的布鲁氏菌病诊断试剂和亚单位疫苗研发提供了参考依据。

东华大学与TATA品牌共创:“苗绘”艺术的跨界融合

苗绣是贵州苗族非物质文化遗产,苗银图案及其精湛技艺底蕴深厚。东华大学携手TATA品牌,推出了一系列龙年主题鞋款,让传统图腾与现代时尚完美交融。这一系列首发的“万物有灵”系列,涵盖了板鞋与乐福鞋两大品类,以丰富的“龙”元素为核心,展现了深厚的文化底蕴与时尚创新的和谐共生。

大肠杆菌Tat转运酶的研究进展

TatA、TatB和TatC是大肠杆菌Tat转运酶的组成成分。研究表明各Tat蛋白具有不同的功能区域,TatA和TatB蛋白功能重要的位点位于N末端的穿膜片断、其后的双极性α-螺旋和铰链区。TatC的序列保守性低,N末端穿膜片断和位于胞质内的第一环区对转运是必需的。Tat转运酶各成分相互结合成复合物形式并相互依赖。TatA在细胞中高表达并自身聚合形成数量不等的同聚物,具有稳定TatBC复合物的作用,TatB有稳定TatC的功能,TatB和TatC两者结合形成二聚体。实验表明,TatA复合物形成转运通道,TatBC复合物通过TatC蛋白识别底物的信号肽并与底物结合,再在TatB介导下与TatA复合物结合形成具有活性的转运酶。

TAT-β-半乳糖苷酶对小鼠生物膜穿透性的研究

为寻找介导外源蛋白质进入组织细胞的生物学方法 ,本研究构建了pET2 8a TAT LacZ重组表达子 ,纯化得到TAT β Gal融合蛋白 ,通过腹腔注射到小鼠体内观察TAT β Gal能否穿过各组织生物膜及达到各组织的时间、浓度。结果发现TAT β Gal在短时间内可到达各组织。该研究证明在生物大分子的N 末端加上TAT具有穿透力的蛋白转导区肽段形成的融合蛋白可穿过生物膜到达各组织 ,这一发现为肽类。

绩效考核在提升检验效率缩短标本TAT中的应用

目的:分析和优化检验常规工作流程,利用绩效杠杆提升检验科检验效率,缩短标本周转时间,提高工作效率和服务质量。方法:采用实验室信息系统(LIS)和DRG软件,制作项目效率考核指标,抓取实时检验效率以及标本TAT时间,从2022年3月试运行考核方案,2022年6月正式考核,回顾性分析6-8月份效率考核情况,9月跟岗调研从人、机、料、法、环、测几个方面,分析TAT延长原因,优化工作流程,缩短标本TAT。结果:检验效率大大提升,从3月的77.46%提升至10月的88.84%。结论:绩效杠杆下的效率考核能有效推动科室提升检验效率,缩短标本TAT。

TAT蛋白介导生物活性蛋白到达缺血灶的研究

目的 :以 β 半乳糖苷酶 (β Gal)为目的蛋白 ,观察TAT蛋白介导其到达缺血灶的情况、及有无血脑屏障 (BBB)的破坏。方法 :构建TAT β Gal融合基因表达质粒 ,转染大肠杆菌BL2 1(DE3)。利用鏊合金属亲合层析法纯化蛋白。将 36只SD大鼠随机分为 3组。其中 2组 ,采用经颈外动脉血管内直接线栓闭塞法 ,建立可复流的大脑中动脉闭塞(MCAO )模型 ,分别腹腔注射TAT β Gal 5mg·kg- 1,β Gal 5mg·kg- 1,并同时注射Evan’s蓝。另一组为假手术组 ,腹腔注射TAT β Gal 5mg·kg- 1。3组分别于给药后 30min ,2h ,4h断头取脑、快速冰冻切片 ,脑切片间隔行x Gal及TTC染色。结果 :MCAO模型SD大鼠 ,腹腔注射TAT β Gal融合蛋白后 ,30min时脑组织各个区域及缺血灶区即可检测到外源性 β Gal的活性 ,4h达高峰 ,同时BBB没有被破坏。而对照组 ,脑组织各个区域未检测到外源性β Gal的活性。结论 :TAT蛋白能有效地介导生物活性蛋白通过BBB进入缺血灶区在脑组织内达到有效浓度。

甲基苯丙胺与HIV-1 Tat蛋白单独及协同诱导神经炎症机制的研究进展

甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)滥用和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染是当今世界面临的极其严重的公共卫生和社会问题。METH与HIV-1 Tat蛋白可单独及协同诱导神经毒性,而神经炎症是引起神经毒性的重要机制之一。神经炎症可由神经胶质细胞、细胞因子、NLRP3炎性小体等介导调控。该文综述了近年来METH与HIV-1 Tat蛋白单独及协同诱导神经炎症机制的研究进展,旨在为将来进一步探索两者协同诱导神经炎症的机制以及有效的药物干预靶点提供参考和依据。

PCT、IL-6与D-Dimer、TAT联合检测评估患者细菌感染程度和发生血栓风险的研究

探讨PCT、IL-6与D-Dimer、TAT联合检测在评估患者细菌感染程度和发生血栓风险的临床应用价值。方法 收集和选用无血栓背景的肺部细菌感染患者样本55例、脓毒血症患者样本66例、无细菌感染的样本10例,总样本量共131例。采用化学发光法(CLIA)检测患者血浆中PCT、IL-6与D-Dimer、TAT的表达水平,比较4中血浆标志物的表达差异。结果 PCT和IL-6联合检测在细菌感染的诊断价值高于PCT和IL-6单项指标的检测价值。D-Dimer和TAT联合检测在血栓形成风险的诊断价值高于D-Dimer和TAT单项指标的检测价值。结论 细菌感染的严重程度与血栓形成的风险呈正相关;采用PCT、IL-6与 D-Dimer、TAT四项联合检测,能同时评估患者细菌感染程度和发生血栓的风险,避免患者因细菌感染而发生血栓,对机体造成更大的伤害,起到早期预警、早期干预、早期治疗的作用。

TAT-PTD融合蛋白可能存在的跨膜递送作用机制

为探讨TATPTD融合蛋白的跨膜递送作用机制,采用DNA重组技术构建pGEXTATGFP表达质粒.在E.coliBL21表达GST-TAT-GFP,并用谷胱甘肽(glutathione)Sepharose4B亲和柱进行纯化.GST-TAT-GFP在不同条件下与细胞的作用结果表明,GST-TAT-GFP能有效进入HeLa、SMMC7721、L02和BEL7402细胞,GST-TAT-GFP在递送时对时间和浓度有依赖关系.同时,温度对GST-TAT-GFP跨膜作用具有明显的影响,GST-TAT-GFP的跨膜作用受代谢抑制剂的影响很小,肝素的存在能明显抑制GST-TAT-GFP跨膜进入细胞的能力,GST-TAT-GFP对细胞活性没有影响.这些结果说明,TATPTD可能是通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素等受体相结合介导融合蛋白跨膜递送进入细胞的.

GO-CoA-Tat改善脂肪肝小鼠脂质代谢和氧化应激

目的探讨饥饿素O-酰基转移酶(ghrelin O-acyltransferase,GOAT)抑制剂GO-CoA-Tat对高脂饮食(high-fat diet,HFD)诱导的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)小鼠脂质代谢和氧化应激的影响。方法选择C57BL/6雄性小鼠24只,分为对照组、HFD组和GO-CoA-Tat组,每组8只。对照组给予标准饮食,HFD组和GO-CoA-Tat组均给予HFD,GO-CoA-Tat组喂养第3周起每天腹腔注射GO-CoA-Tat。每周测量小鼠食物摄入量和小鼠体质量。喂养8周后采集血清及肝脏样本,测量肝脏质量,并采用油红O染色检测肝脏脂滴形成情况;检测并比较3组小鼠血清三酰甘油(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)和肝脏谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)。结果HFD组小鼠喂养8周后出现明显的肝脏脂肪变性;与HFD组相比,GO-CoA-Tat组脂肪变性明显缓解。与HFD组相比,GO-CoA-Tat组小鼠食物摄入量减少、体质量减小、肝脏质量减小(P<0.05)。与HFD组相比,GO-CoA-Tat组小鼠肝脏TG含量降低,血清TG和TC降低(P<0.05);肝脏GSH、SOD浓度升高(P<0.01),MDA浓度下降(P=0.005);血清ALT和AST降低(P<0.05)。结论GO-CoA-Tat可改善NAFLD小鼠肝脏的脂质代谢和氧化应激,从而发挥肝脏保护作用。

pET28a-TAT-LacZ重组子的构建

为了构建高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,观察表达的融合蛋白TAT-β-Gal能否穿过生物膜,使用人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a组氨酸编码区后再连接lacZ基因,组成pET28a-TAT-LacZ重组表达子,转化大肠杆菌,利用组氨酸亲和层析柱纯化TAT-β-Gal融合蛋白,将融合蛋白加入培养的平滑肌细胞。得到高度纯化的、有活性的TAT-β-Gal融合蛋白,TAT-β-Gal在短时间内进入体外培养平滑肌细胞,成功地构建了高表达pET28a-TAT-LacZ重组子,并在体外培养的细胞中证实TAT-β-Gal融合蛋白穿透生物膜的能力,为肽类、生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。

HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

目的:为了方便实验室工作中HIV-1B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a+载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni+金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:PCR拼接获得306bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%。纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应。结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白。

壳牌TAT固定球阀的优化设计

介绍了根据荷兰壳牌(SHELL)球阀技术规范MESC SPE/77-130设计固定球阀的特殊结构特点,壳牌SHELL设计确认型式试验规范MESC SPE/77-300的要求。基于产品TAT型式试验过程出现的问题对影响试验结果的关键部件进行分析,提出TAT固定球阀的结构优化设计。

人免疫缺陷病毒1型TAT突变蛋白及反义TAT RNA对TAT反式激活作用的抑制

Ｔａｔ（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）是人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）基因组编码的反式激活因子，突变分析表明它含有几个重要的功能域。为寻找控制ＨＩＶ复制的途径，构建了以ＨＩＶ－１ＬＴＲ（－１５８－＋８０）为启动子的ＴａｔｃＤＮＡ全长反义表达质粒ｐＡＳ－Ｔａｔ，并用已经构建的以ＨＩＶＬＴＲ－１５８到＋８０为启动子，具有不同突变点的突变Ｔａｔ基因表达质粒，以荧光酶基因为报告基因，共转染Ｊｕｒｋａｔ细胞，结果发现无论是反义Ｔａｔ表达质粒还是突变Ｔａｔ表达质粒，在瞬时转染体系中均能不同程度地抑制Ｔａｔ的活性，其中以ｐＭ５（５２位Ａｒｇ由Ｌｅｕ替代）和反义ＴａｔＲＮＡ的抑制效果最好。结果说明。

河南HIV感染者的HIV-1 B型株tat基因的克隆及序列分析

克隆河南人免疫缺陷病毒(HIV)感染者HIV-1B型株tat基因完整编码框序列,并分析比较其编码产物的序列结构特点。使用重叠PCR技术,从河南省1名HIV-1感染者外周血标本中扩增出tat基因第一和第二外显子并重组为完整的tat基因序列。获得的HIV-1B病毒株tat基因,第一外显子为263bp,第二外显子为214bp。将该基因编码产物与其他HIV-1株Tat蛋白经DNA软件编辑并翻译成蛋白质,使用ClustalX1.81进行多序列对比分析发现,第一外显子编码产物的3个保守区域的氨基酸组成大致相同,只有少数氨基酸存在差异。由于Tat蛋白不同病毒株间有高度保守的Cys富集区、核心区和碱性氨基酸富集区,tat基因的克隆为研究其功能并以其为靶点设计和筛选抗艾滋病的药物奠定了基础。

Tat介导外源蛋白引入活细胞

本文在介绍外源大分子引入细胞的方法及ＨＩＶ－１反式激活因子Ｔａｔ蛋白的结构基础上概述了Ｔａｔ蛋白介导的外源蛋白进入活细胞的方法，并进一步地对其作用机制进行了探讨，认为Ｔａｔ介导的外源大分子引入细胞系统在研究细胞生命活动及临床医学上有重要的意义。

TAT蛋白转导域,Mx基质蛋白以及联合蛋白的研究

TAT蛋白转导域是源自人类免疫缺陷病毒(HIV)PTD蛋白的一段碱性氨基酸蛋白,HIV-Tat蛋白的转导域(PTD)具有穿膜活性,能够将与之共价连接的多肽、蛋白、核酸等生物大分子快速而高效地转导入细胞内部,并且对细胞没有毒副作用,在药物转运和疾病治疗等领域有着巨大的应用潜力。P14是一个致癌基因,具有广谱的抗病毒能力,对RNA病毒,如流感病毒、水泡性口炎病毒、托高土病毒、汉坦病毒和狂犬病毒等有作用,甚至对DNA病毒(如乙型肝炎病毒)也有一定的作用。TAT-p14联合基因具有明显的抗病毒作用,本文论述了TAT蛋白转导域与p14基因联接方法的构建。

血栓前状态标志物F1+2、TAT、AT-Ⅲ、D-Dimer对早期复发性流产的预测价值

【目的】探讨血栓前状态分子标志物:凝血酶原片段F1+2(F1+2)、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ复合物(TAT)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、D-二聚体(D-Dimer)与早期复发性流产(RSA)的关系,及各分子标志物对血栓前状态(PTS)引起的RSA的诊断价值。【方法】比较103例RSA已孕者(AEP组)、103例有RSA病史现未孕者(ANP组)及40例正常早孕者(NEP组)及40例健康未孕者(NNP组)血清中F1+2、TAT、AT-Ⅲ、D-Dimer水平;并以ROC曲线方法判断PTS引起的RSA发生时以上各个指标的最佳临界值。【结果】1.ANP组血浆F1+2、D-Dimer水平显著高于NNP组,两者间差异有显著性(P<0.008);而且流产3次者较2次者指标水平高,差别有统计学意义(P<0.0167)。F1+2与D-Dimer判断RSA未孕患者存在血栓前状态的最佳筛查界值分别为55.11nmol/L(AUC=0.767)及233.50μg/L(AUC=0.636)。2.ANP组血浆TAT水平高于NNP组,AT-Ⅲ水平低于NNP组,但其差别无统计学意义(P>0.008)。AEP组血浆F1+2、TAT、D-Dimer水平高于NEP组,AT-Ⅲ水平低于NEP组,但其差别无统计学意义(P>0.008)。【结论】RSA与PTS存在相关性;RSA患者在孕前已经表现为PTS,PTS的标志物F1+2、D-Dimer可用于RSA未孕人群流产原因的筛查,其水平越高,流产可能性越大。

带Tat标记质粒载体的构建及其转导融合蛋白进入细胞的研究

采用点突变技术构建了带 6×His、Tat和Flag多个标记的pET HTF的质粒载体 ,利用基因重组技术构建pET HTF EGFP融合蛋白载体 .酶切和DNA测序证明 ,所构建的pET HTF和pET HTF EGFP载体正确 .BL2 1(DE3)表达融合蛋白 ,用Ni2 + 分离柱纯化His Tat Flag EGFP蛋白 ,并加入培养的NIH3T3细胞 .荧光显微镜观察显示 ,His Tat Flag EGFP融合蛋白进入细胞 .带His、Tat和Flag标记的质粒载体pET 14b HTF表达的融合蛋白能够进入细胞 。

我国HIV-1 B'/C重组流行株Tat蛋白的表达、纯化及功能分析

根据全国HIV分子流行病学研究发现,B'和C亚型HIV-1在我国发生了重组,并以优势株形式在我国广泛流行。为了探讨这种HIV-1B'/C重组毒株tat基因的变异与其表型之间的关系,利用pET表达系统在大肠杆菌中高效表达了三种不同基因变异类型的Tat蛋白,重组蛋白占菌体总蛋白的26%,Westernblot显示较好的反应原性,并通过金属鏊合层析纯化了目的蛋白。荧光素酶活性检测表明:体外表达的Tat蛋白具有明显的生物学活性,可以反式激活HIVLTR引导的报告基因的表达;三种Tat蛋白在激活活性上的差异与流行现场检测的病毒载量的高低存在明显的对应关系,说明tat基因的变异可以引起病毒生物学特性的改变,进而影响病毒的流行特征。此结果为进一步研究我国HIV重组毒株的基因变异特征及变异规律奠定了基础。