Tat—SmacN7对人乳腺癌细胞系的放射增敏作用

目的观察Tat—SmacN7对人乳腺癌SK—BR-3细胞放射敏感性的影响并探讨其机制。方法取对数生长期乳腺癌SK—BR-3细胞，分为对照组、叮射线照射组、Tat—SmacN7组和Tat—SmacN7联合1射线照射组（联合组）。MTT法检测Tat—SmacN7对SK—BR-3细胞的毒性；克隆形成实验检测Tat—SmacN7的存活分数；单击多靶模型拟合细胞存活曲线并计算放射增敏比（SER）；流式细胞术检测Tat—SmacN7联合1射线照射对细胞凋亡的影响；Westernblot法检测细胞凋亡抑制蛋白XIAP和cIAP-1蛋白表达水平。结果Tat—SmacN7随浓度升高对SK-BR-3细胞的增殖抑制率增大，药物浓度与细胞增殖率呈正相关（r=0．924，P〈0．05），IC50为（62．62±1．19）μmol／L，IC20为（5．66±0．67）μmol／L；5μmol／LTat—SmacN7能增加SK—BR-3细胞的放射敏感性，联合组与照射组放射增敏比为1．48；6Gy．y射线照射后48h，联合组凋亡率显著高于照射组（t=7．01，P〈0．05）；与对照组相比，Tat—SmacN7组XIAP表达水平降低，联合组XIAP和cIAP-1蛋白表达水平均降低。结论Tat—SmacN7通过促进人乳腺癌细胞SK—BR-3细胞的凋亡，增加其辐射敏感性，这一特性与XIAP的表达有关。

Tat-SmacN7诱导肿瘤细胞辐射敏感性的机理研究

探讨Tat-SmacN7诱导食管癌细胞株EC109和非小细胞肺癌细胞株NCL-H460辐射敏感性的机制。采用体外培养EC109细胞和NCL-H460细胞,实验分为对照组、单纯给药组、单纯照射组和给药联合照射组,用RT-PCR检测CAPS8、CASP9和CASP3的转录水平,Fluorogenic caspase assay试剂盒检测Caspase-3、-8、和-9的活性,ELISA方法检测Caspase活性。结果显示,两种肿瘤细胞在使用Tat-SmacN7联合Caspase的抑制剂z-VAD-fmk后,存活曲线较不使用抑制剂组均有明显上移;Caspase-3、-8、和-9的活性在Tat-SmacN7组明显提高,提示Tat-SmacN7可通过细胞凋亡线粒体途径发挥辐射增敏作用,有望成为一种新的辐射增敏剂。

HIV-1 Tat真核表达载体的构建及在Huh-7细胞中表达

目的构建1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)反式激活因子(Tat)基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入人体肝癌细胞系Huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Westernblot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3.1-tat,RT-PCR和Westernblot方法证实该质粒能在Huh-7真核细胞中有效表达HIV-1Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1Tat基因的真核表达质粒载体,并在Huh-7细胞中表达,为在Huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。

TAT-Smad7-HA融合蛋白的表达及其转导活性验证

目的构建、表达、纯化、鉴定并标记TAT-Smad7-HA融合蛋白,验证其在体外培养的人原代瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast cell,KFB)中的转导活性。方法分别将TAT-PTD、Smad7基因和HA片段依次连接入pET32a(+)质粒构建成pTAT-Smad7-HA重组原核表达载体,IPTG诱导表达后经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的片段回收和FITC标记后,将FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白作用于体外培养的人原代KFB以观察其转导活性。结果成功构建了TAT-Smad7-HA融合蛋白的原核表达载体pTAT-Smad7-HA,目的蛋白在诱导后获得了高效表达(占菌体总蛋白的25%以上),并成功进行了纯化(纯度达95%以上)、脱盐柱脱盐、Western blot验证、硫氧环蛋白切除及FITC标记,得到相对分子质量约为50×103的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并进一步在体外培养的人KFB细胞中证实了其高转导活性。结论本实验获得了高纯度的FITC-TAT-Smad7-HA融合蛋白,并验证了其在KFB中的高转导活性。

SmacN7诱导乳腺癌细胞MDA-MB-157凋亡的作用及其机制

目的:探讨SmacN7对乳腺癌细胞MDA-MB-157凋亡的作用及机制。方法:将0-20μmol/L的Smac N7应用于乳腺癌细胞MDA-MB-157,用MTS法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,hoechst33342染色观察细胞核型变化,JC-1染色检测线粒体膜电位,LDH释放实验检测药物细胞毒性,qPCR检测各基因转录水平,并通过抑瘤实验证实该药抑制乳腺癌增殖的作用。结果:应用Smac N7后,乳腺癌细胞MDA-MB-157增殖抑制率和细胞凋亡率均增加(P<0.01),核型发生显著变化,细胞线粒体膜电位降低,LDH释放量增加,并上调TRAIL、DR4、DR5、p53、PARP-1、Bax、Bid、BAK、caspase-3、caspase-8、caspase-9基因的转录水平(P<0.01),下调Ras、PI3K、AKT、mTOR、Bcl2、Bcl-xL、MCL-1、Survivin、cIAP-1、cIAP-2基因的转录水平(P <0.01)。结论:SmacN7可通过TRAIL介导的死亡受体途径和线粒体介导的内源性凋亡途径诱导乳腺癌细胞MDA-MB-157凋亡,发挥抗乳腺癌的作用。

高效液相色谱法分离TAT和TRAT

建立了高效液相色谱分离高能炸药奥克托今(HMX)合成反应前体1,3,5,7-四乙酰基-1,3,5,7-四氮杂环辛烷(TAT)和1,3,5-三乙酰基-1,3,5-三氮六氢均三嗪(TRAT)的分析方法,并利用高效液相-质谱联用技术(HPLC-MS)对TAT和TRAT的色谱峰进行了结构确认。优选后的色谱分离条件为硅胶柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:乙腈:水=75∶25(V/V),流速为1.0mL·min-1,检测波长:215nm,进样量为20μL。在上述条件下,TAT和TRAT分别在10～1000μg/ml和30～1000μg/ml范围内与响应信号呈良好的线性关系(R2=0.9999,R2=0.9996),Rs=1.5。

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型Tat基因真核表达载体的构建

目的：构建人类免疫缺病毒Tat基因真核表达质粒，并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法：以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4—3为模板，通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子，应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pCDNA3．1（＋），构建重组真核表达质粒pCDNA3．1-tat，经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后，应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT—PCR检测其基因转录情况，WesternBlot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果：成功扩增了Tat基因，酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pCDNA3．1-tat，RT—PCR证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达Hiv-1Tat目的片段。结论：成功构建了HIV—ITat基因的真核表达质粒载体，并在huh-7中表达，为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。

Tat-GluR6-9c抑制MLK3-MKK7-JNK信号通路对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区神经元的保护作用

目的探讨小肽Tat-GluR6-9c对混合性的谱系激酶3（MLK3）、丝裂原活化的蛋白激酶激酶7（MKK7）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化水平及蛋白表达的影响，以及对海马CAl区神经元损伤的影响。方法采用4-血管阻塞方法建立大鼠全脑缺血模型，应用免疫印迹的方法分别检测小肽Tat-GluR6-9c对缺血再灌注6h时MLK3、缺血再灌注3d时JNK的磷酸化及蛋白表达水平的影响；采用免疫印迹、免疫组织化学的方法检测小肽Tat—GluR6-9c对缺血再灌注1d时MKK7的磷酸化及蛋白表达水平的影响；采用焦油紫染色方法检测缺血再灌注5d时小肽Tat-GluR6-9c对大鼠海马CAl区神经元损伤的影响。结果Tat-GluR6-9c组MLK3、MKK7及JNK磷酸化水平显著低于缺血再灌注组及对照肽组．海马CAl区神经元存活的数量明显多于缺血再灌注组及对照肽组，差异有统计学意义fP〈0．05）。结论小肽Tat-GluR6-9c能显著抑制脑缺血再灌注诱导的MLK3、MKK7及JNK的磷酸化高峰．降低海马CAl区神经元的损伤。

类Smac小分子SmacN7对人胰腺癌细胞株SW1990凋亡影响的观察

目的:观察外源性类Smac小分子SmacN7对人胰腺癌细胞株SW1990凋亡的影响,以期找到治疗胰腺癌的新方法。方法:使用固相多肽合成技术(SPPS)和反相高效液相层析法(RP-HPLC)制备SmacN7;Heochst 33342染色法观察SW1990分别与PBS液和500ng/mL TRAIL、500μg/mL SmacN7作用24h的细胞凋亡形态;流式细胞术(FCM)检测SW1990分别与500μg/mL SmacN7和500ng/mL TRAIL作用24h的细胞凋亡率(CAR)并观察细胞周期分布;四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测SW1990分别与50、100、200和500μg/mL SmacN7作用24、48和72h的细胞生长抑制率(CGIR);MTT法检测500μg/mL SmacN7分别与200、500、1 000和2 500ng/mL TRAIL或10、20、40和60μmol/L吉西他滨(GEM)联用,与SW1990作用24h的CGIR。结果:SmacN7纯度≥95%,相对分子质量3 278.08,质谱鉴定结果与预期结果完全一致。SW1990与500μg/mL SmacN7作用24h和与500ng/mL TRAIL作用24h细胞形态变化类似,细胞体积和细胞核增大,轻度肿胀,细胞变为短梭形,细胞核呈亮蓝色,分叶或碎片状,边缘集中,且数目更多;细胞周期均显示G0/G1期阻滞,S期比例下降,细胞生长变缓;CAR分别为5.64%和15.30%。SW1990分别与50、100、200和500μg/mL SmacN7作用24、48和72h,CGIR不同,且随SmacN7浓度增加和作用时间延长,CGIR升高,P<0.05;500μg/mL SmacN7分别联合200、500、1 000和2 500ng/mL TRAIL,与SW1990作用24h,SW1990的CGIR为18.11%、37.67%、42.63%和67.60%;分别联合10、20、40和60μmol/L GEM与SW1990作用24h,SW1990的CGIR分别为17.65%、31.85%、40.11%和74.99%。两组均随TRAIL和GEM浓度的增加,SW1990的CGIR升高。结论:SmacN7能促使SW1990凋亡,且有浓度和作用时间依赖性。其作用机制与XIAP表达量降低,细胞色素C和Caspase-3活性裂解片段p17表达量升高有关。SmacN7有可能成为治疗胰腺癌的新方法。

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。

艾滋病治疗靶点的新技术研究进展

艾滋病是世界范围内的一类公共卫生问题和社会问题,目前主要采用抗反转录病毒治疗,虽然通过该方法在一定程度上达到了有效控制艾滋病的目的,但是并不能彻底清除潜伏状态的人类免疫缺陷病毒,并且患者耐药问题也日益严重。基于艾滋病治疗的现状,研究者利用免疫、细胞和基因工程技术发展了新型的防治方法。本研究基于辅助受体趋化因子受体5、跨膜蛋白gp41、TAT蛋白、p7核衣壳蛋白和核酸内切酶等在艾滋病治疗中较有潜力的靶点,阐述艾滋病治疗的研究现状和发展前景,为艾滋病的临床治疗提供参考。