PPARγ激动剂通过Akt信号转导通路抑制HIV-1 Tat诱导的血管炎性反应

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)对人类免疫缺陷病毒-1型反式转录激活因子(HIV-1transactivator of transcription,HIV-1Tat)诱导的脑微血管内皮细胞中黏附分子反应的影响及其作用机制。方法将培养的人脑微血管内皮细胞(human cerebral microvascular endothelial cells,hCMEC/D3)给予HIV-1Tat、PPARγ激动剂罗格列酮、PPARγ拮抗剂GW9662、蛋白激酶B(Akt)抑制剂KP3721进行干预,并设立对照组。分别以蛋白免疫印迹法和实时反转录聚合酶链式反应检测hCMEC/D3中细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)蛋白和mRNA表达。结果 HIV-1Tat可诱导黏附分子ICAM-1和VCAM-1的蛋白(P<0.05,P<0.01)及其mRNA表达增加(均P<0.01),PPARγ激动剂罗格列酮可抑制HIV-1Tat诱导的ICAM-1蛋白(P<0.05)与mRNA以及VCAM-1的mRNA表达(均P<0.01),而这种抑制作用可被PPARγ拮抗剂GW9662和Akt抑制剂KP3721逆转(均P<0.01)。罗格列酮可抑制HIV-1Tat诱导的Akt磷酸化反应(P<0.01)。结论 PPARγ可抑制HIV-1Tat诱导的脑微血管内皮细胞中黏附分子反应,Akt信号转导通路在PPARγ激动剂抑制血管内皮细胞炎性反应中起到重要的作用。

Tat穿膜肽的临床应用研究进展

穿膜肽Tat(transcriptional activator protein)是一种带正电荷的短肽,可以协助大分子物质进入哺乳动物细胞。最近的研究表明,多种与Tat融合的物质能够穿过细胞膜而且可以发挥其生物学功能。这项技术对结合物的大小没有严格的限制,即使是原本无法使用的大分子物质也有可能用于治疗疾病。Tat已经在肿瘤、糖尿病、免疫治疗等临床领域展现出很大的研究价值,并且已经取得了不少新的进展,具有广泛的应用前景。

His-TAT-mCherry融合蛋白的跨膜转导及其在细胞内的定位

目的构建在原核中表达的人类免疫缺陷病毒转录活化因子(HIV-TAT)红色荧光蛋白(mCherry)融合表达载体,荧光显微镜观察HIV-TAT的跨膜转导及其在细胞内的定位,为进一步研究HIV-TAT的跨膜转导机制及其定位提供重要工具。方法采用基因重组技术构建含HIV-TAT以及红色荧光蛋白的质粒pET14b-His-TAT-mCherry,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,将该质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使其在体外表达,并进行纯化、除菌。将纯化的His-TAT-mCherry融合蛋白与Hela细胞共同孵育,荧光显微镜下观察。结果PCR、双酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;表达纯化出了高纯度的His-TAT-mCher-ry融合蛋白。荧光显微镜下见Hela细胞中红色荧光蛋白主要分布在胞质中,细胞膜上也有一定分布。结论成功构建了pET14b-His-TAT-mCherry原核表达质粒,纯化了高纯度的His-TAT-mCherry融合蛋白,该蛋白在哺乳动物细胞中有跨膜转导活性,为研究HIV-TAT的跨膜转导机制提供了一个重要的工具。

HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达及免疫原性分析

目的研究对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型HXB2株调控蛋白Tat原核表达产生影响的区域和Tat蛋白重要的抗原表位。方法用PCR方法获得Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)和Tat(38-101aa)DNA片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa),并转入E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物。采用间接ELISA方法用兔抗pET32a-Tat抗血清对三种肽段进行免疫原性分析。结果成功构建了pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa)质粒,分别表达出相对分子质量(Mr)为23×103、23×103和25×103的融合肽段,其浓度分别为4.26、3.35和5.11mg/ml。间接ELISA结果表明三种融合肽段与兔抗pET32a-Tat抗血清均呈特异性结合反应,其抗体滴度分别为1:128000、1:32000、1:64000,而抗血清与pET32a蛋白仅有较弱结合。结论半胱氨酸富集区(22-37位氨基酸)对Tat蛋白的原核表达有较显著影响;Tat蛋白的N端区、碱性区和C端区是其重要的抗原表位,其中N端区的免疫原性最强。

TAT蛋白介导生物活性蛋白到达缺血灶的研究

目的 :以 β 半乳糖苷酶 (β Gal)为目的蛋白 ,观察TAT蛋白介导其到达缺血灶的情况、及有无血脑屏障 (BBB)的破坏。方法 :构建TAT β Gal融合基因表达质粒 ,转染大肠杆菌BL2 1(DE3)。利用鏊合金属亲合层析法纯化蛋白。将 36只SD大鼠随机分为 3组。其中 2组 ,采用经颈外动脉血管内直接线栓闭塞法 ,建立可复流的大脑中动脉闭塞(MCAO )模型 ,分别腹腔注射TAT β Gal 5mg·kg- 1,β Gal 5mg·kg- 1,并同时注射Evan’s蓝。另一组为假手术组 ,腹腔注射TAT β Gal 5mg·kg- 1。3组分别于给药后 30min ,2h ,4h断头取脑、快速冰冻切片 ,脑切片间隔行x Gal及TTC染色。结果 :MCAO模型SD大鼠 ,腹腔注射TAT β Gal融合蛋白后 ,30min时脑组织各个区域及缺血灶区即可检测到外源性 β Gal的活性 ,4h达高峰 ,同时BBB没有被破坏。而对照组 ,脑组织各个区域未检测到外源性β Gal的活性。结论 :TAT蛋白能有效地介导生物活性蛋白通过BBB进入缺血灶区在脑组织内达到有效浓度。

Tat蛋白对人脑内皮细胞闭锁蛋白表达的影响

目的探讨重组Tat蛋白对人脑内皮细胞闭锁蛋白的影响。方法采用Weksler′s方法分离和处理人脑血管内皮细胞。采用一步法定量反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)分析基因的m RNA转录水平。依据Reyes′s法,利用蛋白免疫印迹实验检测闭锁蛋白的表达,并进行免疫荧光检测,荧光显微镜观察分析图像。结果重组Tat蛋白可以降低闭锁蛋白的转录和蛋白的表达。在重组Tat蛋白处理30 min后闭锁蛋白的m RNA水平开始出现明显抑制(P<0.05),重组Tat蛋白处理1、2、6、12、24 h时闭锁蛋白的m RNA水平分别为0.66、0.55、0.58、0.54、0.53,与对照组(重组Tat蛋白处理即刻,0 min)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。闭锁蛋白水平在6 h内保持不变,12、24 h时分别为0.71、0.61(P<0.05)。同时,荧光显微镜也观察到了组织学改变。未处理组闭锁蛋白的染色强且均匀。细胞经重组Tat蛋白处理24 h后,闭锁蛋白的染色明显减弱。结论重组Tat蛋白能够破坏血-脑脊液屏障的完整性,可以抑制闭锁蛋白的表达。

穿透肽TAT融合表达载体的优化及其靶向应用的初步研究

目的设计并构建分别位于融合蛋白氨基端和羧基端的穿透肽TAT表达载体,比较两种融合蛋白的内化差异,并利用TAT将凋亡素VP3转导入细胞内,检测其促凋亡活性。方法荧光显微镜观察His-TAT-EGFP和His-EGFP-TAT融合蛋白内化效率的差异,并利用Western blotting检测内化入细胞的蛋白量。将VP3序列插入到内化效率高的穿透肽载体pET14b-EGFP-TAT中并诱导表达蛋白,观察该蛋白在不同细胞系(HeLa、HEK293、3T3、PC-3)的内化;利用DAPI染色观察该融合蛋白诱导HeLa细胞凋亡后核小体的形成,MTT法检测细胞存活率。结果在蛋白浓度梯度实验中,荧光显微镜观察和Western blotting检测均显示His-EGFP-TAT融合蛋白的内化效率明显高于His-TAT-EGFP融合蛋白。在不同种类细胞中均可观察到His-VP3-EGFP-TAT内化的强荧光颗粒;该蛋白和对照蛋白(His-EGFP-TAT)孵育HeLa细胞48h后,His-VP3-EGFP-TAT孵育细胞中可观察到核小体形成,MTT法检测该组细胞的存活率在500、1000、2000nmol/L蛋白作用下分别为87.23%±2.09%、53.01%±1.79%和42.52%±1.90%,与His-EGFP-TAT孵育细胞存活率(分别为97.21%±1.41%、95.72%±1.26%和94.35%±1.67%)比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 TAT位于融合蛋白羧基端的蛋白内化活性高于位于氨基端的蛋白,His-VP3-EGFP-TAT融合蛋白可以高效内化进入不同的细胞系,并能有效诱导细胞凋亡。

具有细胞穿透功能的串联亲和层析分离载体的构建与功能鉴定

目的建立基于抗生蛋白链菌素结合肽(SBP)-钙调蛋白结合肽(CBP)分离标签以及细胞穿透肽转录反式激活因子(TAT)和绿色荧光蛋白(GFP)原核表达系统的、具有细胞穿透功能的原核串联亲和层析分离系统。方法应用PCR方法,以pEG-FP-C2载体为模板扩增EGFP序列,以pNTAP载体为模板扩增CBP-SBP序列,采用退火方法得到TAT片段,采用常规酶切、连接方法将EGFP、CBP-SBP和TAT片段依次克隆入pET14b-MCStop载体中,酶切、PCR和测序鉴定无误后,得到pET14b-CBP-SBP-EGFP-TAT重组质粒。将重组质粒转化BL21(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析纯化获得融合蛋白,将不同浓度的融合蛋白加入培养的人肝癌细胞株(HepG2)检测融合蛋白的穿细胞膜功能。结果所构建的pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体正确,该载体可在大肠埃希菌内高效表达,用Ni2+-NTA纯化获得了相对分子量约40kD的目的融合蛋白。细胞功能实验结果表明融合蛋白能够穿越细胞膜,且具有浓度依赖性。结论成功构建了pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体,并获得了具有良好穿透真核细胞膜功能的融合蛋白,为进一步研究细胞内蛋白相互作用、细胞穿透肽TAT的功能及其穿透细胞的机制奠定了基础。

人类免疫缺陷病毒储存库评估测定技术研究进展

HIV整合至CD4＋T细胞、脾脏、淋巴结、胃肠相关淋巴组织中，成为HIV潜伏感染的储存库。学界提出“shock and kill”的治疗策略，即先激活释放再杀灭病毒。而实施该策略的前提是评估和测定HIV储存库的大小。本文介绍目前常用的测定HIV储存库方法如Alu-gagPCR、定量病毒产物分析及tat／rev诱导有限稀释法。Alu．gagPCR可区别整合与未整合病毒基因，但不能区分缺陷与有功能的前病毒，因此易高估储存库。定量病毒产物分析在纯化静止CD4＋T细胞中进行，被誉为HIV储存库检测的“金标准”，但实验成本高，技术要求高，所需标本量大，仅由一轮激活并不能完全诱导产物释放，因此会低估储存库。Tat／rev诱导有限稀释法主要测定经由刺激物诱导表达多拼接RNA等生物学标志的潜伏感染细胞频数，具有所需血标本少，不用抽提病毒RNA，实验时间短，对于不同大小储存库都适用等优点，但可能高估潜伏储存库。

HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性

目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。

TAT-血红素氧合酶-1融合蛋白对L-02细胞的转导效果

目的观察TAT-血红素氧合酶-1（HO-1）融合蛋白对L-02细胞的转导能力、细胞毒性和转导后细胞内HO-1活性，评价其转导效果。方法L-02细胞与FITC标记的TAT-HO-1融合蛋白孵育4h后，荧光显微镜下观察TAT-HO-1融合蛋白转导入L-02细胞的情况。L-02细胞与TAT-HO-1融合蛋白孵育4h后，采用CCK-8方法测定L-02细胞的活力，采用化学法测定HO-1活性。结果与FITC标记的TAT-HO-1融合蛋白孵育后，L-02细胞内均匀分布绿色荧光；与TAT-HO-1融合蛋白孵育后，L-02细胞活力无明显改变，HO-1活性明显升高。结论TAT-HO-1融合蛋白可有效地转导入L-02细胞，可明显提高细胞内HO-1活性，且无细胞毒性。

HIV Tat_(49-57)增强人乳头瘤病毒16E7细胞毒性T细胞表位穿膜效应研究

目的探讨有穿膜序列HIV Tat_(49-57)的人乳头瘤病毒(HPV)16E7限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位融合肽的跨膜能力及其影响因素。方法在HPV16E7 HLA-A2^+/H-2k^(b+)限制性CTL表位E7_(49-57)的N末端连接穿膜肽HIV Tat_(49-57)序列,应用固相技术合成此融合肽,用间接免疫荧光与激光共聚焦显微技术,研究其穿膜能力,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测其体外诱导特异性CTL杀伤效应。结果穿膜序列HIV Tat_(49-57)可以有效促进HPV16E7_(49-57)表位肽进入BHK细胞胞浆,并呈时间、剂量依赖关系(P＜0．05)；与原表位肽相比,该融合肽有显著地激发特异性CTL活性的能力。结论在原CTL表位基础上引入穿膜序列,可以使其更快速、更有效地进入活细胞胞浆,为HPV16肽疫苗的设计提供一种新的思路。

TAT-血红素氧合酶-1融合蛋白对原位肝移植术大鼠肝损伤的影响

目的 评价TAT-血红素氧合酶-1（TAT-HO-1）融合蛋白对原位肝移植术大鼠肝损伤的影响.方法 选择健康成年雄性近交系Lewis大鼠为供体,BN大鼠为受体,8～10周龄,体重180～230 g.采用随机数字表法,将受体大鼠分为2组（n=6）：肝移植组（OLT组）和TAT-HO-1融合蛋白组（TAT-HO-1组）.采用改良Kamada二袖套法建立原位肝移植术模型.TAT-HO-1组植入经含TAT-HO-1融合蛋白50μg/ml的HTK液冷保存6h的肝脏.于移植后7d,经腹主动脉采血样2 ml,测定血清ALT和AST的活性.取肝脏,HE染色,光镜下观察肝组织病理学结果,计算排斥活动指数.采用ELISA法检测肝组织转化生长因子-β1（TGF-β1）及IL-6的含量.分离Kupffer细胞培养,测定培养液TGF-β1及IL-6的水平.结果 与OLT组比较,TAT-HO-1组血清ALT及AST的活性、排斥活动指数、肝组织和Kupffer细胞培养液TGF-β1及IL-6的水平降低（P＜0.05）,肝组织病理学损伤减轻.结论 在供肝冷保存期间,应用TAT-HO-1融合蛋白可减轻原位肝移植术大鼠肝损伤.

融合蛋白TAT-NEP1-40对PC12细胞氧糖剥脱模型保护作用的研究

目的观察融合蛋白TAT-NEP1-40的细胞转导功能及其对PC12细胞氧糖剥脱模型(OGD)损伤的保护作用。方法含80nmol/L浓度TAT-NEP1-40的DMEM培养液孵育PC12细胞60min后,用免疫荧光染色法检测该融合蛋白的细胞转导功能;以Na2S2O4造成缺氧合并缺糖模拟PC12细胞缺血性损伤,分别给予TAT-NEP1-40、TAT-β-gal及β-gal等进行处理,利用MTT比色法、FCM法及Hoechst33258染色法检测PC12细胞存活情况并计算保护率,观察TAT-NEP1-40对模拟PC12细胞缺血性损伤的保护作用。结果 (1)TAT-NEP1-40蛋白能跨细胞膜进入PC12细胞;(2)该蛋白具有保护作用,最大保护率为66.8%;(3)该蛋白能提高PC12细胞拟缺血损伤时的存活率,TAT-NEP1-40较OGD模型组高,活细胞生存率分别为(90.05±1.83)%、(77.10±2.00)%,P<0.05。结论融合蛋白TAT-NEP1-40具有细胞转导功能,对体外模拟PC12细胞缺血性损伤具有保护作用。

Tat蛋白与Plk1相互作用位点的鉴定

目的确定Tat蛋白与Plk1的相互作用及作用位点。方法构建tat和plk1基因的不同表达载体,通过GST-pull down、免疫共沉淀检测它们表达产物的相互作用位点,激光共聚焦确定其在细胞内的定位。结果 GST-pull down和免疫共沉淀实验发现Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域,激光共聚焦发现Tat蛋白和Plk1在细胞核内有相同的亚细胞定位。结论 Tat蛋白能结合在Plk1 N端的激酶区域引起Plk1 T210的磷酸化水平提高,从而激活Plk1的活性,导致细胞周期的紊乱。

PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体的构建

目的 构建蛋白质转导结构域4-铜锌超氧化物歧化酶（PTD4-Cu,Zn-SOD）原核重组表达载体.方法 利用基因重组技术,设计Cu,Zn-SOD特异性引物和PTD4寡核苷酸序列,Cu,Zn-SOD基因进行PCR反应,产物进行鉴定、回收和纯化,以pET16b为载体,经Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切反应、连接反应和质粒转化,构建pET16b-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,再分别将PTD4基因和pET16b-Cu,Zn-SOD载体经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切反应、连接反应和质粒转化,构建pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,并进行限制性内切酶谱分析和基因测序.结果 成功构建了长度为6 207 bp的pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体,用Nde Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,得到约5.7 kb的载体片段和约510 bp的PTD4-Cu,Zn-SOD基因片段,与预期结果一致.pET16b-PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体基因测序结果与预期的基因序列相比,碱基序列均正确.结论 成功构建了PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体.

PTD4．Cu，Zn—SOD融合蛋白的制备

目的制备蛋白质转导结构域4-铜锌超氧化物歧化酶（PTD4-Cu，Zn-SOD）融合蛋白。方法分别将pET16b-Cu，Zn-SOD蛋白和pET16b-PTD4-Cu，Zn-SOD重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞E.coli BL21（DE3）中；加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（终浓度0.84 mmol/L）孵育4 h，诱导Cu，Zn-SOD和PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白表达；经过溶菌酶和超声裂解细菌，取上清液，行15% SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达情况。利用Ni-NTA His结合树脂在天然条件下纯化获得Cu，Zn-SOD蛋白和PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白，采用Western blot法鉴定目的蛋白。结果Western blot结果显示目的蛋白纯度为90%，可见分子量约为19 kDa的Cu，Zn-SOD蛋白条带和分子量约为20 kDa的PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白条带。结论成功制备了PTD4-Cu，Zn-SOD融合蛋白。