SYBRGreen荧光定量PCR检测HTLV-I前病毒tax基因方法的建立

目的建立HTLV—I前病毒tax基因的荧光定量PCR检测方法。方法根据HTLV—Itax基因序列设计引物，将PCR克隆的tax片段链接入质粒载体，经筛选鉴定后，以含有目的片断的质粒为阳性模板建立实时荧光定量检测方法。结果扩增体系的敏感度可达10拷贝／反应。模板浓度在10^5～10^1拷贝／反应时，模板浓度与循环闽值（Q）之间相关性良好，相关系数r=-0，9987，且模板浓度相同的反应管之间具有良好的重复性和稳定性。结论SYBRGreen荧光定量PCR检测HTLV—I前病毒tax基因方法具有简便、快速和灵敏度高等优点，可能在疾病诊断、监测以及血液筛查中具有一定的应用前景。

HTLV-1 Tax基因真核表达载体的构建及对RPE细胞的影响

目的构建人T淋巴细胞白血病病毒-1(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)Tax基因真核表达载体,在人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达Tax蛋白,观察其对细胞的影响。方法应用基因重组技术构建重组载体PIRES2-EGFP-Tax(PT),鉴定后将重组载体转染入RPE细胞,应用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测细胞内Tax基因和蛋白的表达;通过MTT和流式细胞仪检测质粒(空白载体、PT和Green-Tax)转染RPE细胞24h和48h后对RPE细胞生长活力及细胞周期的影响。结果经双酶切鉴定和测序分析证实成功地构建了HTLV-1Tax真核表达载体;通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测到转染Tax重组载体的RPE细胞中有Tax基因和蛋白的表达。质粒转染RPE细胞后,细胞生长活力受到抑制,G1期减少而S期增加。但转染Tax质粒和空白载体,对RPE细胞的生长活力和细胞周期产生相似影响。结论成功构建了HTLV-1Tax基因真核表达载体,并在RPE细胞中表达Tax蛋白;Tax质粒对RPE细胞的影响不排除是转染试剂所致。

上海地区HTLV—Ⅰ相关高危人群病毒感染的检测

目的建立人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ（HTLV—Ⅰ）前病毒的核酸检测方法，对HTLV—Ⅰ相关高危标本进行检测，初步了解上海地区HTLV-1在相关疾病和高危人群中的流行特点，探讨核酸检测法在HTLV—Ⅰ高危人群中的检测意义。方法实验收集了69例淋巴瘤／白血病患者，72例有多次输血史的其他血液病患者以及1例HTLV—Ⅰ相关脊髓病（HAM）／热带痉挛性下肢瘫痪（TSP）疑诊患者血液标本。采用荧光定量PCR筛查HTLV-1前病毒tax基因，酶联免疫法检测血清HTLV—Ⅰ／Ⅱ抗体，对上述2种检测中出现任一阳性结果的标本进一步采用nest—PCR检测HTLV-1前病毒env基因以确定HTLV—Ⅰ的感染。结果仅HAM／TSP疑诊患者tax基因扩增出现阳性曲线；ELISA检测标本血清HTLV—Ⅰ／Ⅱ抗体均为阴性；nest—PCR扩增env基因未见特异性条带。结论上海地区小样本HTLV—Ⅰ相关高危人群中未检出HTLV—Ⅰ感染；建立的核酸检测方法能对HTLV—Ⅰ病毒感染进行有效的筛查和确认。

个人所得税调节收入分配差距的作用分析

选取基尼系数作为衡量收入差距大小的指标,分别计算了我国1998年—2014年城镇居民税前与税后收入的基尼系数,以此来分析个人所得税这一税收政策调节城镇居民收入分配差距的作用效果。结果表明,我国城镇居民收入差距从1998年—2014年呈不断扩大的趋势,个人所得税调节收入分配差距的作用效果总体比较微弱。最后针对个税调节收入分配差距作用微弱的原因进行分析,并提出相应对策,以期个人所得税的调节作用能够得到更好的发挥。

HTLV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞DcR3基因表达的影响

目的探讨H1]LV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞DeR3基因表达的影响。方法构建pGL3-DeR3-luc（-1010bp-＋114bp）荧光素酶报告基因；利用脂质体介导的方法将pGL3-DcR3-luc转染到MT-2、TaxP、Jurkat细胞中，48h后检测DcR3荧光素酶报告基因的活性；利用脂质体介导的方法将梯度剂量的pCMV-Tax转染入Jurkat细胞，48h后提RNA逆转录，real-timePCR检测DeR3mRNA的表达的变化；选用流式细胞技术检测MT-2、TaxP、Jurkat细胞表面DeR3蛋白的表达。结果成功构建DcR3基因调控序列荧光素酶报告基因pGL3-DeR3．1ue；荧光素酶活性的检测显示，与对照组相比，MT2细胞荧光素酶活性升高了32．07±12．43倍，TaxP细胞荧光素酶活性升高了13．27＋4．04倍，Jurkat细胞荧光素酶活性升高了1．26_＋0．49倍。与Jurkat细胞相比，MT2细胞和TaxP细胞的相对荧光素酶活性明显升高（P〈0．01）；Real-timePCR结果显示，4组Ct内参／Ct目的基因的值依次是0．40±0．02、0．44±0．01、0．47±O．02、0．53±0．02；DeR3mRNA的表达与转染pCMV-Tax存在着剂量依赖性（P〈0．05）。流式细胞技术检测，MT2和TaxP细胞实验组DcR3蛋白的表达较对照组Jurkat细胞表达的高（P〈0．05）。MT2细胞的结果是33．1±9．9，Ta）‘P细胞的结果是35．1±4．8，Jurkat细胞的结果是16．9±2．3。结论Tax蛋白能够促进DeR3基因在T细胞中的表达。

HTLV-1 Tax蛋白阳性T细胞中EGR-1表达调控机制的研究

目的：探讨成人T淋巴细胞白血病病毒1型（ HTLV-1病毒） Tax蛋白阳性T细胞TaxP中早期生长反应基因-1（EGR-1）表达调控的机制。方法构建不同长度的EGR-1调控序列报告基因，将其转染TaxP细胞，加入NF-κB抑制剂BAY 11-7082或同等体积的二甲基亚砜（DMSO），24 h后收集细胞检测荧光素酶活性；TaxP细胞上清中加入BAY 11-7082或同等体积的DMSO，24 h后免疫印迹检测EGR-1蛋白表达；将Tax及其突变体M22和M47分别转染293 T细胞，24 h后免疫印迹检测EGR-1蛋白表达。结果成功构建了不同长度及突变体的EGR-1调控序列荧光素酶报告基因；荧光素酶报告基因检测显示：相对于E1、E2而言， E3、DelE、MutE的荧光素酶活性明显降低，加入BAY 11-7082后，E1、E2的荧光素酶活性明显降低（P＜0．01），而E3、DelE、MutE无明显变化；同样地，免疫印迹检测显示加入BAY 10-7082后，EGR-1蛋白表达明显降低；相对于野生型和M47，转染M22突变体后，293 T细胞EGR-1蛋白表达明显降低。结论 NF-κB是Tax蛋白阳性T细胞中EGR-1表达调控的关键核因子。

HTLV-1 Tax蛋白对T细胞中HMGB1调控的影响

目的探讨人T淋巴细胞白血病1型病毒（humanT—cellleukemiavirus1，HTLV-1）Tax蛋白对人高迁移率族蛋白1（highmobilitygroupbox1，HMGB1）基因转录调控的影响。方法提取TaxN和TaxP细胞总RNA和蛋白质，通过real—timePCR和Westernblot分析HMGB1mRNA和蛋白质的表达情况；利用脂质体介导方法，将6个含有不同长度HMGB1调控序列的pGL3-HMGB1-luc瞬时转染至TaxN和TaxP细胞，观察HMGB1基因在不同T细胞中的转录活性；pCMV—Tax与pGL3-HMGB1-luc瞬时共转染至Jurkat细胞，观察Tax蛋白对HMGB1基因的转录调控影响；染色体免疫共沉淀（ChIP）找寻Tax蛋白影响HMGB1基因转录调控的区段。结果TaxP细胞中HMGB1mRNA和蛋白质表达水平高于TaxN细胞。TaxN和TaxP细胞中HMGB1调控趋势基本相似，均表现出3号质粒（pHLuc3，含有-504～＋83HMGB1区段）的相对荧光素酶活性（HMGB1／neo）最高，但是6号质粒（含有-1163-＋83HMGB1区段）却表现出TaxP细胞HMGB1的转录活性明显高于TaxN细胞。pCMV．Tax与pGL3．HMGB1．Luc报告基因共转染到Jurkat细胞也显示，6号质粒（pHLuc6）中Tax促进HMGB1基因的转录。ChIP分析证实了Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163—-1043区段。结论-504—-383可能是HMGB1基因转录激活的关键启动子区，Tax蛋白可能富集在HMGB1的-1163～-1043区段促进HMGB1基因转录。