SYBRGreen荧光定量PCR检测HTLV-I前病毒tax基因方法的建立

目的建立HTLV—I前病毒tax基因的荧光定量PCR检测方法。方法根据HTLV—Itax基因序列设计引物，将PCR克隆的tax片段链接入质粒载体，经筛选鉴定后，以含有目的片断的质粒为阳性模板建立实时荧光定量检测方法。结果扩增体系的敏感度可达10拷贝／反应。模板浓度在10^5～10^1拷贝／反应时，模板浓度与循环闽值（Q）之间相关性良好，相关系数r=-0，9987，且模板浓度相同的反应管之间具有良好的重复性和稳定性。结论SYBRGreen荧光定量PCR检测HTLV—I前病毒tax基因方法具有简便、快速和灵敏度高等优点，可能在疾病诊断、监测以及血液筛查中具有一定的应用前景。

HTLV-1 Tax基因真核表达载体的构建及对RPE细胞的影响

目的构建人T淋巴细胞白血病病毒-1(human T-cell leukemia virus type1,HTLV-1)Tax基因真核表达载体,在人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞表达Tax蛋白,观察其对细胞的影响。方法应用基因重组技术构建重组载体PIRES2-EGFP-Tax(PT),鉴定后将重组载体转染入RPE细胞,应用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测细胞内Tax基因和蛋白的表达;通过MTT和流式细胞仪检测质粒(空白载体、PT和Green-Tax)转染RPE细胞24h和48h后对RPE细胞生长活力及细胞周期的影响。结果经双酶切鉴定和测序分析证实成功地构建了HTLV-1Tax真核表达载体;通过RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测到转染Tax重组载体的RPE细胞中有Tax基因和蛋白的表达。质粒转染RPE细胞后,细胞生长活力受到抑制,G1期减少而S期增加。但转染Tax质粒和空白载体,对RPE细胞的生长活力和细胞周期产生相似影响。结论成功构建了HTLV-1Tax基因真核表达载体,并在RPE细胞中表达Tax蛋白;Tax质粒对RPE细胞的影响不排除是转染试剂所致。

人T细胞白血病病毒T_(ax)基因与宿主细胞的相互作用

人 T淋巴细胞白血病病毒 (HTL V - )可导致成人 T淋巴细胞白血病 (A TL )。临床多以外周血 T淋巴细胞的恶性增殖为特征 ,并伴有 T淋巴细胞的形态异常。H TL V- Tax基因编码的蛋白在 T淋巴细胞癌变过程中起重要作用。通过病毒基因的构成 ,着重介绍

人类T细胞白血病1型病毒Tax蛋白的研究进展

人T细胞白血病1型病毒(HTLV-1)是成人T细胞白血病(ATL)的致病因素,其编码的Tax蛋白在ATL形成中有重要作用。Tax蛋白能够诱导HTLV-1感染的细胞内核因子κB途径的活化、促进细胞增殖、抑制多种DNA修复机制以及诱导基因组的不稳定性等作用,最终使HTLV-1感染的CD4+T细胞转化为ATL细胞。

TAX1BP1调控B细胞自噬和凋亡的研究

目的探究TAX1BP1在B细胞自噬与凋亡中的作用。方法慢病毒感染B淋巴瘤细胞(Raji细胞),敲低TAX1BP1表达。利用雷帕霉素处理Raji细胞,通过Western blot、细胞免疫荧光染色和流式细胞术,观察自噬流强弱以及细胞凋亡情况。通过检测自噬相关通路P53蛋白表达变化,初步探索调控机制。结果荧光显微镜观察慢病毒感染阳性率在90%以上。与阴性组比较,shTAX1BP1组细胞中TAX1BP1的mRNA表达水平降低80%、蛋白表达水平降低90%。经10 nmol/L雷帕霉素处理后,与阴性组相比较,shTAX1BP1组LC3II/I比值显著下降(P<0.01),凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著升高,Bax、Caspase-3表达显著下降。敲低TAX1BP1降低Raji细胞自噬水平,减少Raji细胞凋亡。敲低TAX1BP1增加P53蛋白表达,推测TAX1BP1可能通过P53相关通路调控Raji细胞的自噬与凋亡。结论敲低TAX1BP1可抑制Raji细胞自噬与凋亡,初步预测这一生物学作用可能与P53信号通路有关。本研究为进一步探讨SLE的发病机制奠定了一定的实验基础。

上海地区HTLV—Ⅰ相关高危人群病毒感染的检测

目的建立人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ（HTLV—Ⅰ）前病毒的核酸检测方法，对HTLV—Ⅰ相关高危标本进行检测，初步了解上海地区HTLV-1在相关疾病和高危人群中的流行特点，探讨核酸检测法在HTLV—Ⅰ高危人群中的检测意义。方法实验收集了69例淋巴瘤／白血病患者，72例有多次输血史的其他血液病患者以及1例HTLV—Ⅰ相关脊髓病（HAM）／热带痉挛性下肢瘫痪（TSP）疑诊患者血液标本。采用荧光定量PCR筛查HTLV-1前病毒tax基因，酶联免疫法检测血清HTLV—Ⅰ／Ⅱ抗体，对上述2种检测中出现任一阳性结果的标本进一步采用nest—PCR检测HTLV-1前病毒env基因以确定HTLV—Ⅰ的感染。结果仅HAM／TSP疑诊患者tax基因扩增出现阳性曲线；ELISA检测标本血清HTLV—Ⅰ／Ⅱ抗体均为阴性；nest—PCR扩增env基因未见特异性条带。结论上海地区小样本HTLV—Ⅰ相关高危人群中未检出HTLV—Ⅰ感染；建立的核酸检测方法能对HTLV—Ⅰ病毒感染进行有效的筛查和确认。

HTLV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞DcR3基因表达的影响

目的探讨H1]LV-1病毒Tax蛋白对T淋巴细胞DeR3基因表达的影响。方法构建pGL3-DeR3-luc（-1010bp-＋114bp）荧光素酶报告基因；利用脂质体介导的方法将pGL3-DcR3-luc转染到MT-2、TaxP、Jurkat细胞中，48h后检测DcR3荧光素酶报告基因的活性；利用脂质体介导的方法将梯度剂量的pCMV-Tax转染入Jurkat细胞，48h后提RNA逆转录，real-timePCR检测DeR3mRNA的表达的变化；选用流式细胞技术检测MT-2、TaxP、Jurkat细胞表面DeR3蛋白的表达。结果成功构建DcR3基因调控序列荧光素酶报告基因pGL3-DeR3．1ue；荧光素酶活性的检测显示，与对照组相比，MT2细胞荧光素酶活性升高了32．07±12．43倍，TaxP细胞荧光素酶活性升高了13．27＋4．04倍，Jurkat细胞荧光素酶活性升高了1．26_＋0．49倍。与Jurkat细胞相比，MT2细胞和TaxP细胞的相对荧光素酶活性明显升高（P〈0．01）；Real-timePCR结果显示，4组Ct内参／Ct目的基因的值依次是0．40±0．02、0．44±0．01、0．47±O．02、0．53±0．02；DeR3mRNA的表达与转染pCMV-Tax存在着剂量依赖性（P〈0．05）。流式细胞技术检测，MT2和TaxP细胞实验组DcR3蛋白的表达较对照组Jurkat细胞表达的高（P〈0．05）。MT2细胞的结果是33．1±9．9，Ta）‘P细胞的结果是35．1±4．8，Jurkat细胞的结果是16．9±2．3。结论Tax蛋白能够促进DeR3基因在T细胞中的表达。

NFκB与成人T淋巴细胞白血病关系的研究进展

在成人T淋巴细胞白血病(ATL)细胞中,人类T细胞白血病Ⅰ型病毒(HTLV-Ⅰ)非结构基因编码的TAX蛋白对调节病毒的复制和核因子κB(nuclear factor kappa B,NFκB)的激活起关键作用。NFκB是一类细胞核转录因子,它能通过经典的TAX蛋白激活途径或者通过不依赖TAX蛋白的途径而活化,使得宿主细胞CD4^+T淋巴细胞内一系列与细胞增殖存活有关的基因表达,如细胞因子、细胞凋亡调控蛋白、抗凋亡蛋白等,最终细胞无限增殖和转化导致ATL的发生,近些年NFκB已被作为治疗ATL的分子靶点。

HTLV-Ⅰ tax反义RNA逆转小鼠神经纤维瘤

来源于转基因小鼠 (HTLV ⅠLTRtax基因 )的神经纤维瘤细胞系的细胞中 ,外源基因HTLV Itax高表达产生mRNA和蛋白质 ,使细胞出现转化表型 .当将反向插入了HTLV ItaxcDNA的逆转录病毒导入这种细胞后 ,转录生成的反义RNA可抑制tax基因的表达 ,mRNA和蛋白质均减少 40 %强 ;细胞的形态和生长特征也随之发生明显变化 ;原先由Tax蛋白质激活的基因如GM CSF ,IL 6,LT/TNF (蛋白质水平 ) ,c myc和LIF(mRNA水平 )等的表达均下调 ;M CSF(蛋白质水平 )和原癌基因c src(mRNA水平 )的表达上升 ;β 肌纤蛋白mRNA则不受影响 .这些变化可能是由于tax反义RNA降低了细胞内Tax蛋白质浓度的缘故 .这表明HTLV ⅠTax蛋白质维持转化细胞的形态、生长和增殖起关键性作用 ;由Tax蛋白质激活的细胞内源基因的表达受阻 ,则是转基因小鼠发生神经纤维瘤的原因 .