Screening and characterization of a high taxol producing fungus by protoplast mutagenesis

The preparation, regeneration and mutagenesis of the taxol-producing fungus UV40-19 protoplasts were discussed in the experiment. Totally 42 strains displayed hygromycin resistance. Six strains were found to be positive mutants when screened on plate containing 90μg/mL hygromycin. One hereditarily stable strain UN05-6 was obtained, which raised the taxol yield from （376.38 ± 8.41）μg/L to （493.12 ±11.36） μg/L. The optimal conditions for the preparation, regeneration and mutagenesis of the taxol producing fungus UV40-19 were as follows： 1 ）enzymolysis in a solution containing 3% lywallzyme, 4% snailase, 1% lysozyme and 3% cellulose at 30~C water bath, pH5.5 - 6.0 for 5h; 2） The prepared protoplasts were regenerated by using bilayer plate culturing method; 3）To mutagenize the fungus UV40-19, the protoplast suspension was treated with 0.8mg/mL NTG for 15min, followed by UV irradiation （30W, 30cm distance）for 40s under magnetic stirring. The purified products of the fungus UN05-6 fermented extracts have significant inhibitive effects on SMMC-7721 cell.

Screening and breeding of high taxol producing fungi by genome shuffling

To apply the fundamental principles of genome shuffling in breeding of taxol-producing fungi, Nodulisporium sylviform was used as starting strain in this work. The procedures of protoplast fusion and genome shuffling were studied. Three hereditarily stable strains with high taxol production were obtained by four cycles of genome shuffling. The qualitative and quantitative analysis of taxol produced was confirmed using thin-layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) and LC-MS. A high taxol producing fungus, Nodulisporium sylviform F4-26, was obtained, which produced 516.37 μg/L taxol. This value is 64.41% higher than that of the starting strain NCEU-1 and 31.52%―44.72% higher than that of the parent strains.

产紫杉醇菌株原生质体诱变育种的研究

对紫杉醇产生菌NCEU_1的原生质体进行了紫外线和氯化锂复合诱变,筛选制霉菌素抗性突变株,共筛选出了4株正突变株。经发酵筛选试验,获得了一株遗传性状稳定、高产紫杉醇的原生质体诱变菌株———UL04-5,其紫杉醇产量从出发菌株的314.07μgL提高至418.24μgL。

紫杉醇高产菌株的原生质体诱变选育及其遗传变异初探

以紫杉醇产生菌NCEU_1为出发菌株,分别采用紫外线和紫外线与氯化锂复合诱变方法对其原生质体进行诱变,获得了两株高产紫杉醇的突变株———UV4 0 - 1 9和UL50 - 6 ,其紫杉醇产量从出发菌株的314 0 7μg L分别提高至376 38μg L和392 6 3μg L ;同时,又采用RAPD和同工酶技术对出发菌株NCEU_1与两高产株UV4 0 - 1 9和UL50 - 6 间的遗传差异进行了研究。结果表明,出发菌株与诱变菌株之间以及两诱变菌株之间都存在明显差异。

产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备与再生

以产紫杉醇内生真菌XT5为供试菌株，研究了酶系组成、酶解时间、酶解温度、菌体培养方式、菌龄等因素对产紫杉醇内生真菌XT5原生质体制备和再生的影响。结果表明：将内生真菌XT5在PDA液体培养基中静止培养12-16h，离心收集菌体，用0．7mol／L的NaCI配制成的含有2％0纤雏素酶＋1％蜗牛酶的复合酶，32℃恒温酶解2h，原生质体制备率最高；以上述条件酶解1．5h左右，采用双层平板培养法于32℃再生，获得的原生质体再生率最高为12．4％．

东北红豆杉紫杉二烯合成酶cDNA克隆及其与紫杉醇产生菌基因组DNA的Southern杂交(英文)

为进一步研究紫杉二烯合成酶的作用机理和紫杉醇生物合成代谢调控机制,采用RT-PCR技术从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯合成酶基因片段,将该片段克隆在载体pGEMT-easy vector上,并转化到E.coliJM109中,经EcoRI酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定,获得紫杉二烯合成酶基因片段长度为909 bp,编码303个氨基酸,与GenBank中收录的紫杉二烯合成酶的同源性达到98%;对获得的紫杉二烯合成酶基因和紫杉醇产生菌HQD33基因组DNA进行了Southern杂交。结果初步证实了紫杉二烯合成酶存在于通过内生真菌发酵生产紫杉醇的生物合成途径中。为利用分子生物学手段研究通过内生真菌发酵生产紫杉醇生物合成的代谢调控和构建高产紫杉醇基因工程菌株提供了强有力的理论指导。

紫杉醇产生菌HU1353分类地位的探讨

研究了从东北红豆杉(Taxus cuspidarta)树皮中分离到的一株内生真菌HU1353,经微生物发酵法证明可产生紫杉醇后,进一步对其群体形态和个体形态进行了观察,并探讨其分类地位为链格孢属(Alternaria)一新种。模式菌株保存于黑龙江大学微生物重点实验室。

紫杉醇产生菌及其工程菌株之间的AFLP遗传差异分析

采用AFLP技术对三株紫杉醇产生菌(HQD33、HQD48、HQD54)及HQD33菌株经复合诱变后再经原生质体诱变得到的两株诱变株UL50-6和UV40-19及其融合菌株J1-3进行了分析,结果表明三株紫杉醇产生菌分属不同的种属,同时首次从分子水平上证实Z35-8、J1-3为两株不同的融合子,为下一步的基因工程育种工作中的基因定位和分子克隆提供丰富可靠的分子标记。

一种适合抗癌药紫杉醇产生菌AFLP分析的DNA提取方法

比较研究了2种常规的DNA提取方法及一种新改进的抗癌药紫杉醇产生菌DNA提取方法.结果表明,CTAB提取法DNA产量低,多糖和蛋白质含量高;高盐低pH法(SD S法)提取DNA的产量较高,蛋白质和多糖含量高,需要进一步去除;新改进的DNA提取方法,DNA产量极高,而且蛋白质含量和多糖含量也低,适合AFLP分子标记技术对该菌的分子生物学研究.

紫杉醇产生菌生物多样性研究进展

紫杉醇是一种二萜多氧伪生物碱,其药用价值广泛,抗癌机理独特,是目前最好的抗癌药物之一。利用微生物发酵生产紫杉醇可能是未来解决药源短缺问题的理想途径。介绍了紫杉醇的药用价值和抗癌机理,并总结了紫杉醇产生菌生物多样性及其来源的相关研究进展,最后对紫杉醇产生菌的未来研究方向做出了展望,以期为紫杉醇药物的研发提供参考。

真菌紫杉醇/烷研究近况

紫杉醇(Taxol)是天然抗癌药物,已在临床上广泛使用,市场需求量大,由于生产原料的制约,供需之间存在巨大缺口,价格仍然昂贵。利用真菌发酵生产紫杉醇是解决药源的一条新途径。对产紫杉醇内生真菌的多样性,紫杉醇真菌的采集鉴定、真菌紫杉醇提取和测定的一些经验,紫杉醇真菌分子生物及生物合成代谢研究进展等进行了综述。