Dynamic Effects of Cerium on Syntheses of Soluble Protein and Taxol in Suspension Culture of Taxus Chinensis Var. Mairei Cells

The dynamic effects of Ce4+ on the syntheses of soluble protein and taxol in suspension cultures of Taxus chinensis var. mairei cells were studied. The phenomena of 'partition' and 'bifurcation' were observed in studying the dynamic effect of Ce4+ on soluble protein synthesis and cell activity. That is, Ce4+ of low concentration improves the soluble protein synthetic strength and cell activity, while Ce4+ of high concentration is harmful to protein synthesis and cell activity. In addition, Ce4+ of appropriate concentration enhances taxol synthesis.

光胁迫对南方红豆杉叶片中叶绿体色素和紫杉醇含量的影响

研究了在光胁迫下南方红豆杉叶片中叶绿体色素含量和紫杉醇含量的动态变化。结果表明,与对照相比,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量以及叶绿素a/叶绿素b比值在光胁迫下均减少,随胁迫时间的延长,叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量逐渐上升,叶绿素a与叶绿素b的比值先上升后下降;类胡萝卜素含量在前两周与对照相比降低,2周后高于对照;类胡萝卜素与叶绿素的比值高于对照,随胁迫时间的延长,其趋势先降低后上升。光胁迫处理后,南方红豆杉叶片中紫杉醇含量与对照相比,在第1周时略有下降,而后随胁迫时间的延长,紫杉醇含量在第2周开始迅速大量积累,而在处理3周时达到较高值,已增加到1.5倍,这对提高人工种植的南方红豆杉中紫杉醇含量具有非常重要的意义。

南方红豆杉产紫杉醇内生真菌的分离鉴定

从南方红豆杉(Taxus chinensisvar.mairei)植株分离到内生真菌63株,其中24株经鉴定分属于19个种(属).真子囊菌纲的2个属2株,半知菌纲的14个属22株.真子囊菌纲的无毛毛壳属(Achaetomiumsp.)的1株为新发现种.半知菌纲的葡萄孢属(Botrytissp.)1株和无孢菌群(Mycelia sterlia)2株的培养液,经浓缩萃取,薄层层析检测,Rf值分别为0.404、0.404、0.401,与紫杉醇对照品Rf值一致,为南方红豆杉产紫杉醇内生真菌.

不同激素处理对南方红豆杉扦插苗的影响

以清水处理为对照,使用不同激素(ABT1号生根粉、NAA、IBA)处理南方红豆杉插穗,从而研究不同激素处理对南方红豆杉扦插苗生根率、生物量及紫杉醇含量的影响。结果表明:ABT处理下,南方红豆杉扦插苗的生根率、生根数、新生枝叶数以及紫杉醇的含量均为最高。因此,用ABT处理南方红豆杉插穗优于其他激素处理。

铈对悬浮培养南方红豆杉细胞可溶性蛋白和紫杉醇合成动态的影响

研究Ce4+ 对悬浮培养南方红豆杉细胞可溶性蛋白和紫杉醇合成的动态影响。Ce4+ 对可溶性蛋白合成和细胞活力的影响存在“分区”和“分叉”现象 ;低浓度Ce4+ (0 10mmol·L- 1 )可显著提高可溶性蛋白的合成强度和细胞活力 ,高浓度Ce4+ (5 0 0mmol·L- 1 )对细胞表现为强伤害作用。适宜浓度Ce4+ (1 0 0mmol·L- 1 )在短期内可大幅度提高紫杉醇的合成速度 。

南方红豆杉生长发育及其紫杉醇含量与环境因子的关系

研究了人工种植的3年生南方红豆杉的生长发育特征及其枝叶中紫杉醇的含量,并观测了其生长环境因子的动态特征。通过对南方红豆杉的生长发育特征以及其枝叶中紫杉醇含量与生长环境因子进行相关分析发现,南方红豆杉生长发育与空气和土壤湿度呈极显著的正相关,与空气和土壤温度、土壤N和K含量、土壤有机质和土壤紧实度呈正相关,与净辐射和土壤P含量呈负相关,但相关关系不显著,说明高温、高湿以及遮荫有利于南方红豆杉的生长,且对土壤P含量有较高需求;南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量与空气和土壤湿度、土壤N、P和K含量呈负相关,与净辐射、空气和土壤温度、土壤有机质和土壤紧实度呈正相关,但相关关系均不显著,说明高温、高光强和干旱促进南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量的增加,且紫杉醇含量的增加对土壤中N、P和K含量有一定的需求,尤其是N和K,对P需求不大;南方红豆杉生长发育与其枝叶中紫杉醇含量呈负相关,相关关系也不显著,推测紫杉醇可能是南方红豆杉的防御物质,以促使南方红豆杉抵御高温、干旱和高光强等不良环境。

不同遮荫强度下南方红豆杉枝叶紫杉醇产量的季节变化

研究了在一个生长季节内遮荫网不同遮荫强度下对人工种植的南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)枝叶生物量、紫杉醇含量和产量季节变化。结果表明,在遮荫网89%和46.4%遮光条件下,南方红豆杉枝叶生物量、紫杉醇含量及其产量随发育节律呈现明显的规律性季节变化。在遮荫网89%和46.4%遮光条件下,89%遮荫条件下南方红豆杉枝叶生物量在整个生长季节内都明显高于46.4%遮荫条件下南方红豆杉枝叶生物量;在遮荫网89%和46.4%遮光条件下南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量在5月中旬、7月末和11月末都出现较高峰值,后者紫杉醇含量峰值都明显比前者紫杉醇的含量高;89%和46.4%遮荫网遮光条件下南方红豆杉枝叶中紫杉醇的产量都在11月末期时达到最高,后者明显高于前者。因此,生产实践中可采用46.4%遮荫网遮光,采收的最佳季节为11月末期。

南方红豆杉组织培养和紫杉醇含量测定

比较了从南方红豆杉的芽及幼茎诱导愈伤组织的情况 ,并对愈伤组织的增殖条件进行了研究 ,利用 HPLC方法测定了愈伤组织合成紫杉醇的能力 ,结果表明以芽作为外植体在附加2 .0 mg/L 2 ,4-D和 0 .5 mg/L NAA的 MS培养基上 ,产生愈伤组织的速度较快 ,诱导效果最好 ,第 5天即有愈伤组织发生 ,且诱导率可达 1 0 0 % .附加 0 .5 mg/L 2 ,4-D,1 .0 mg/L NAA和0 .5 mg/L KT的 B5培养基较适合愈伤组织的增殖 ,生长率达 7.74g/L,紫杉醇含量达干重的0 .0 0 98% .

紫杉醇合成途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

【目的】研究紫杉烯合成酶超表达对紫杉醇代谢的影响,以提高红豆杉属植物细胞中紫杉醇的含量。【方法】从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)愈伤组织提取总RNA,根据已发表的中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA序列设计两对引物,通过RT-PCR技术扩增出该酶5′端长度为1 201 bp和3′端长度为1 388 bp的两个cDNA片段,将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E.coli DH5α中,5′端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定,3′端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后,对阳性克隆进行序列测定。两片段与双元载体pCAMBIA1300-35S::GUS以T4 DNA连接酶连接并转化到E.coli DH5α中,经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定。【结果】测序结果证实确为紫杉烯合成酶基因,酶切结果证实紫杉烯合成酶cDNA全长连接成功并插入到pCAMBIA130035S::GUS中。【结论】两cDNA片段拼接得到全长2 589 bp的紫杉烯合成酶基因,编码862个氨基酸,与中国红豆杉紫杉烯合成酶基因具有98%的同源性;成功构建了pCAMBIA130035S-TS载体,为下一步的转基因工作做好了准备。

南方红豆杉组织培养及紫杉醇的产生

南方红豆杉茎段愈伤组织在不同基本培养基及激素组合的培养基上，其平均鲜重生物量具显著差异，而干重生物量无差异。适宜浓度的ＮＡＡ可以取代常用的、但具致癌活性的２，４－Ｄ。ＴＡ或Ｂ５基本培养基附加１．０ｍｇ／ＬＮＡＡ和０．５ｍｇ／ＬＢＡ为其愈伤组织生长的适宜配方。经有机溶媒提取、硅胶柱层析分离、薄层层析检识证明愈伤组织中含有紫杉醇和１０－脱乙酰基巴卡丁－Ⅲ。

影响南方红豆杉细胞生长及紫杉醇含量的因素

研究了影响南方红豆杉细胞生长及紫杉醇含量的稀土和氮源。结果表明 ,较低浓度(1× 10 -5mol L)的稀土元素对南方红豆杉细胞的生长及紫杉醇的合成有一定促进作用 ,较高浓度 (1× 10 -4 mol L)的稀土元素则起抑制作用。 3种稀土中以使用 10 -5mol L的镱效果最好。当NH+4 NO-3 质量浓度比例为 2 2 5以及总氮源浓度为 2 7mmol L时 。

不同产地南方红豆杉枝叶的紫杉醇含量及其指纹图谱的比较分析

采用HPLC法对来源于6个产地(陕西周至和汉中;甘肃天水;安徽胡乐、聂家山和仙寓山)的12份野生南方红豆杉〔Taxus chinensis var.mairei(Lemée et Lévl.)Cheng et L.K.Fu〕枝叶中的紫杉醇含量进行了比较分析,并对不同产地南方红豆杉指纹图谱的相似度进行了比较和特征指纹图谱的构建。结果表明:不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇的含量有明显差异,来源于陕西和甘肃的枝叶样品中紫杉醇含量明显高于来源于安徽的样品,以产自陕西周至的枝叶样品中紫杉醇含量最高(0.019 3 mg.g-1)。各样品的指纹图谱均有12个共有峰,其中9号共有峰的保留时间(32.75 min)与紫杉醇标准品一致,被确定为南方红豆杉指纹图谱的参照峰(s)。各共有峰相对保留时间的RSD值均低于1%,但相对峰面积的RSD值均高于40%,说明各样品共有峰的保留时间稳定,但相对含量差异较大。除来源于安徽聂家山的2个样品外,其他样品的相似度值均在0.8以上,说明各样品间指纹图谱的相似度较高。根据12个样品的指纹图谱建立了南方红豆杉枝叶的特征指纹图谱,可用于南方红豆杉的鉴定及质量控制。由测定结果推测:不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量的差异可能与生长环境的差异有关。

南方红豆杉外植体母株来源与培养基成分对愈伤组织生长和紫杉醇的影响

目的建立和优化获得量大而高紫杉醇愈伤组织的培养技术和方法.方法以山西陵川县野生和在西安栽培的南方红豆杉为材料,就最佳母株、外植体种类、基本培养基、植物激素种类及浓度对愈伤组织诱导、生长和紫杉醇的影响等因素进行了系统研究.结果幼茎外植体因诱导的愈伤组织时间早、频率高而最佳;培养基Y5:MS+2,4-D 4.0 mg/L+KIN 1.0 mg/L或B5Ⅲ:B5+2,4-D 3.0 mg/L+KIN 0.1 mg/L+Phe 0.1 mol/L为最佳诱导愈伤培养基,其诱导频率高达100%.继代培养基中质量浓度2,4-D(0.5～3 mg/L)促进愈伤组织增殖;高质量浓度(8 mg/L)则有抑制作用.当2,4-D质量浓度适宜时,愈伤组织在B5培养基上较在MS培养基上褐化轻、生长快.HPLC分析表明紫杉醇最高的继代培养基为MSⅢ,其紫杉醇质量分数高达干重的0.004%;野生母株幼芽来源的愈伤组织,其紫杉醇普遍高于栽培母株幼茎来源的愈伤组织.结论以5月份野生红豆杉幼茎为外植体,以Y5或B5Ⅲ为诱导培养基和继代培养基,继代8～10代,每代培养30～35 d;用MSⅢ培养基再培养1～2代,收获愈伤组织或细胞培养物,并从中提取紫杉醇是获得大量高紫杉醇愈伤组织的较佳培养程序.

南方红豆杉紫杉烷高含量植株系RAPD初步研究

南方红豆杉（Ｔａｘｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ． ｍａｉｒｅｉ（Ｌｅｍｅｅ ｅｔＬｅｖｌ．） Ｃｈｅｎｇ ｅｔＬ．Ｋ．Ｆｕ） 是我国提取抗癌药紫杉醇的原料植物之一，但分布于不同地区的南方红豆杉其紫杉醇含量差异很大。应用ＲＡＰＤ技术，用２１ 个引物共扩增２５６ 条条带，其中有２２４ 条有多态性（８７．８ ％） 。结合紫杉烷及紫杉醇含量测定和植物形态分类，初步探讨了紫杉烷高含量植株的分子特征、形态和生境的相互关系。在供试的１２ 个地区２４ 个样品中，提出３ 个地区存在紫杉烷高含量植株系的可能性。

南方红豆杉内生真菌Bionectria sp.的分离、鉴定及代谢产物活性研究

从南方红豆杉树皮中分离到30株内生真菌,结合形态学和ITS-5.8S rDNA序列两种鉴定方法,确定其中1株(XH004)为生赤壳属(Bionectria)真菌,这是目前世界上首次从红豆杉科植物中分离到该属内生真菌.通过抑菌实验、细胞毒实验、TLC检测和HPCL检测证明XH004代谢产物具有明显的抗菌和杀细胞作用,且极可能含有紫杉醇或紫杉醇类似物.

南方红豆杉细胞双液相培养中强化紫杉醇生产的研究

研究了南主红豆杉(Taxuschinensisvar.maireiChengetFu)细胞双液相培养中前体饲喂和混合糖源作为生产培养基糖源对细胞生长和紫杉醇合成的影响。结果表明,前体饲喂(苯丙氨酸、苯甲酰胺和醋酸钠)或混合糖(麦芽糖和蔗糖)作为生产培养基糖源对南方红豆杉细胞单液相培养、更重要的是对其双液相培养的紫杉醇产量提高有显著促进作用,而且前体饲喂和混合糖源的协同作用对其双液相培养的紫杉醇产量提高有进一步的促进作用。与对照组(蔗糖作为糖源和无前体的单液相培养)相比,在南方红豆杉细胞双液相培养中,第10天加入前体,第11天加入混合糖源。

稀土和氮源对南方红豆杉细胞生长及紫杉醇积累的影响

研究稀土和氮源在 B5培养基上对南方红豆杉细胞悬浮培养时的影响 .结果表明 :在所研究的 3种稀土元素中 ,1× 1 0 - 5mmol/L的 Yb Cl3,最利于细胞生长和紫杉醇的积累 ,紫杉醇含量达1 .3 46mg/L.氮源总浓度 (包括 NH4 +和 NO3- )为 2 7mmol/L,NH4 +和 NO3-比例为 2 /2 5 ,有利于南方红豆杉细胞生长和紫杉醇的合成 .

外源紫杉醇作用下南方红豆杉细胞凋亡及其动力学研究

利用光学显微照相技术、细胞总DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL标记等手段 ,研究了外源紫杉醇(Taxol)作用下南方红豆杉细胞的凋亡及其动力学。研究结果表明 ,外源紫杉醇能显著提高南方红豆杉细胞凋亡的速率和发生率 ,表明高浓度紫杉醇不利于细胞的生长。

南方红豆杉细胞培养中生产紫杉醇的研究进展

南方红豆杉是红豆杉科红豆杉属在中国的一个变种,是红豆杉属植物中紫杉醇含量较高的一种,但由于南方红豆杉野生资源稀少,故紫杉醇的产量有限,远不能满足市场对紫杉醇的需求。在红豆杉细胞培养中生产紫杉醇是未来相关研究的重要方向。综述了有关南方红豆杉愈伤组织诱导、细胞悬浮培养中生产紫杉醇的研究现状与研究进展,分析了南方红豆杉组织与细胞培养研究中存在的问题,并提出了可能解决的方法。

代谢中间产物和诱导子对南方红豆杉培养细胞生长和紫杉醇含量的影响

以南方红豆杉 (Taxuschinensisvar.meirei)悬浮细胞为材料 ,利用紫杉醇合成途径中 3 -羟基 -3 -甲基戊二酸还原酶 (HMGR)抑制剂研究其合成途径的多样性 ,以及代谢中间产物 (牛儿醇 ,牛儿牛儿醇 ,蒎烯 ,甲瓦龙酸 )和诱导子 (花生四烯酸 ,茉莉酸甲酯 )对培养细胞生长和紫杉醇含量的影响 ,以探讨紫杉醇生物合成途径人工调控的可能性。结果 :从培养细胞生长曲线看 ,细胞干重和紫杉醇含量均在培养第 30天达到最高 ,HMGR抑制剂compactin对紫杉醇生物合成的抑制作用不明显 ;在培养开始时 ,加入牛儿牛儿醇 (5mg/L)能显著提高紫杉醇含量 ,牛儿醇 (10mg/L)、甲瓦龙酸 (10 0mg/L)对紫杉醇的合成也有一定的促进作用 ,而蒎烯(10mg/L)没有作用 ;加入花生四烯酸 (3 .2 μmol/L)和茉莉酸甲酯 (10 0 μmol/L)分别提高紫杉醇含量 1倍和 10倍。结论 :在南方红豆杉培养细胞中 ,紫杉醇生物合成除了经典的乙酸 /甲羟戊酸途径外 ,还可能存在其他途径。加入合适的代谢中间产物的诱导子可以提高植物培养细胞中的紫杉醇含量 ,但由于其生物合成步骤复杂 。