Determination of 10-Deacetyl baccatin Ⅲ and BaccatinⅢ in Taxus yunnanensis

报道了一种在Ｃ＿（１８）高效液相色谱柱上分离紫杉醇（Ｔａｘｏｌ）的前体化合物ＢａｃｃａｔｉｎⅢ和１０－去乙酰ＢａｃｃａｔｉｎⅢ的分析方法。所用流动相为甲醇－水（５２：４８），必要时可使用水－乙腈－四氢呋喃（６７：２５：８），流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ，检测波长２２７ｎｍ。运用此方法对云南红豆杉不同部位（干皮、枝、叶、心木）的若干样品进行了测定，发现ＢａｃｃａｔｉｎⅢ和１０－去乙酰ＢａｃｃａｔｉｎⅢ在各部位间含量差异较大，即使同一部位也有很大差异。

Cu^(2+)、前体对红豆杉细胞生长及产生10-Deacetyl Baccatin的影响

目的:研究前体和Cu2+诱导子对云南红豆杉细胞生长和产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响。方法:在培养12d后分别向培养基中添加不同浓度的乙酸钠、苯甲酸钠两种前体和CuSO4诱导子,经过培养对云南红豆杉细胞生长情况进行统计,用HPLC测定细胞中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。结果:培养基中添加0.1mmol/L乙酸钠和0.1mmol/L苯钾酸钠,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量是不添加时的1.8倍和2.8倍,含量分别为0.079 88%、0.082 91%;B5培养基中添加0.1mg/L硫酸铜时,10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量是B5培养基标准含量的2.2倍。结论:确定了云南红豆杉细胞悬浮培养过程中B5培养基添加乙酸钠、苯甲酸钠和硫酸铜的最佳浓度,表明适宜浓度前体和Cu2+诱导子对10-去乙酰巴卡亭Ⅲ合成与释放有显著影响。

南方红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的分离与纯化

目的:以南方红豆杉的枝叶为原料,研究其中活性成分10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)的分离和纯化条件,并进行优化筛选。方法:综合运用浸提、萃取(包括液液萃取和反萃取)、色谱分离和重结晶技术得到10- DABⅢ晶体,并采用UV,HPLC法进行分析鉴定。结果:得到了用以合成高效抗癌药紫杉醇的前体——10-DABⅢ晶体,纯度可达91%,整个工艺收率达7．9%。结论:本实验为首次采用该工艺路线得到10-DABⅢ和紫杉醇,总收率达60%以上,可用于进一步的工业化研究。

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合成前体巴卡亭Ⅲ产量的目的,并且为进一步利用组合表达系统商业化生产紫杉醇奠定基础。

南方红豆杉菌根菌液体纯发酵培养产紫杉醇及10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

从南方红豆杉菌根菌中筛选出产紫杉醇和紫杉烷类化合物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)的高产菌株,对分离获得的21株菌株进行了液体发酵培养实验,通过TLC、HPLC及LC-MS检测发现,有10株菌株具有产紫杉醇及紫杉烷类化合物的能力,其中4株菌株中产10-DAB分别为260.05、92.88、393.27、70.52μg/L,但未检出产紫杉醇;6株中产紫杉醇分别为434.94、1 242.19、200.65、360.77、317.90、29.82μg/L,但未检出产10-DAB,说明南方红豆杉的各种菌根真菌虽具有合成紫杉醇或紫杉烷类化合物的能力,但各自所合成化合物有差异,不同种类的菌根菌可能分别参与了紫杉醇生物合成的不同环节,即南方红豆杉菌根高含量紫杉醇的生物合成可能是多种菌根菌协同参与作用的结果,且其中的高产菌株具有发酵生产紫杉醇的潜力。

CO_2超临界流体-夹带剂法从南方红豆杉中萃取10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ的工艺条件研究

目的:研究用乙醇作夹带剂,采用CO2超临界法从南方红豆杉中萃取10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ的最佳工艺条件;方法:采用正交试验法探讨萃取时间、压力、温度、夹带剂用量对从南方红豆杉中萃取10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ的影响;结果:CO2超临界流体-夹带剂法从南方红豆杉中提取的10-脱乙酰巴卡丁Ⅲ的最佳工艺条件是萃取压力20MPa、萃取温度50℃、萃取时间150min、夹带剂用量为20ml/200g原料。此条件下萃取率最高可达到443.342μg/g。

培养基和培养条件对云南红豆杉细胞生长量及产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响

[目的]探讨云南红豆杉细胞生产10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响条件。[方法]研究不同培养基、培养温度和光照强度对云南红豆杉细胞生长量和产生10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的影响。[结果]结果表明,BTM培养基中细胞生长量和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别是B5培养基中的1.7倍和2.6倍;20℃培养时细胞生长量和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别是30℃时的1.5倍和5.7倍;暗培养细胞生长量和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量分别是强光照(3 000 lx)培养时的2.5倍和4.4倍。[结论]该研究结果为云南红豆杉细胞培养生产10-去乙酰巴卡亭Ⅲ提供依据。

超临界CO_(2)萃取南方红豆杉中挥发油和10-DABⅢ的工艺优化

目的 优化超临界CO_(2)萃取法萃取南方红豆杉中挥发油和10-DABⅢ的工艺条件。方法 以萃取时间、萃取温度、萃取压力、分离温度、物料与夹带剂的比例和夹带剂浸泡时间等为考察因素,以红豆杉中挥发油的得率和10-DABⅢ的含量为评价指标,采用正交试验优选最佳工艺条件。结果 最佳工艺条件为以无水乙醇为夹带剂,物料与夹带剂比例为1:3,萃取压力270 bar、萃取温度35℃、分离温度40℃,萃取时间2.5 h。红豆杉挥发油的得率为23.422%,10-DABⅢ的含量0.546‰。结论 所用工艺稳定、可行,可用于红豆杉中挥发油和10-DABⅢ的提取。

紫杉醇及其前体在中国红豆杉植株中合成和积累部位探讨

研究紫杉醇及其重要前体物质巴卡亭Ⅲ在中国红豆杉(Taxus chinenesis)中合成和积累部位,通过HPLC分析代谢产物在中国红豆杉植物中的空间分布,定量PCR技术研究代表紫杉醇合成途径中不同步骤的6种关键酶基因在植株中的表达特征。结果表明,巴卡亭Ⅲ主要分布在针叶中,而紫杉醇主要分布在树皮和树根皮中;针叶中,紫杉醇代谢途径上游步骤的关键酶基因表达水平较高,树皮中催化紫杉醇侧链连接的酶转录表达水平高,而树皮中能检测到较高含量的6种关键酶基因的表达。表明紫杉醇的骨架结构主要在针叶中合成,而树皮中转化这些前体物质生成紫杉醇的能力较强,树根中含有完整的紫杉醇代谢酶系,暗示根组织培养是生产紫杉醇很有前景的方法。进一步建立了组织扦插培养红豆杉离体组织体外生产紫杉醇的系统。在茉莉酸甲酯的诱导下,红豆杉针叶在体外能够生产紫杉醇;树皮中由于缺乏足够的前体物质,离体培养中紫杉醇含量不断下降;枝叶培养中,产生的紫杉醇主要集中在树皮中。上述研究结果暗示,紫杉醇及其前体物质在中国红豆杉体内存在转移现象。

中国红豆杉中多种紫杉烷同时检测的液质联用方法的建立

目的:建立能同时检测中国红豆杉中微量紫杉醇、10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)、巴卡亭Ⅲ(B-Ⅲ)、巴卡亭Ⅵ(B-Ⅵ)和1-乙酰-5,7,10-去乙酰巴卡亭Ⅰ(DAB-Ⅰ)等多种紫杉烷的方法,了解该植物中重要紫杉烷的分布和代谢特征。方法:采用电喷雾质谱(ESI-MS)和多级离子阱技术摸索紫杉烷的加合离子峰和碎裂离子出现规律,利用反相高效液相色谱法同时测定植物样品中5种紫杉烷的含量。植物样品用液氮快速研磨,甲醇浸提,固相萃取方法制样。色谱柱为 HypersilODS C_(18)(250mm×4.6mm,5μm),流动相为乙腈-甲醇-水(32:20:48),等度洗脱,流速为1mL·min^(-1),检测波长为227nm。结果:具有多个乙酰取代基的紫杉烷在 ESI-MS 正离子扫描时,产生强的铵加合离子峰,含羟基的紫杉烷易产生质子加合峰。最低检测限为0.5～1.5mg·L^(-1),紫杉醇在2.0～180mg·L^(-1)(r=0.9993),10-DAB 在2.0～166.0mg·L^(-1)(r=0.9975),B-Ⅲ在6～170mg·L^(-1)(r=0.9937),B-Ⅵ在7.0～200.0mg·L^(-1)(r=0.9921),DAB-Ⅰ在1.0～130mg·L^(-1)(r=0.9945)范围内具有良好的线性关系。紫杉醇回收率为98%±1.5%,日内 RSD 为1.8%,日间 RSD 为2.5%。结论:应用该方法测定了中国红豆杉不同组织中相应紫杉烷的含量,得到了良好的结果。

低氮培养基对紫杉愈伤组织形成及紫杉醇生物合成的影响

本文使用两种改良培养基(SSS和RW培养基)与B5培养基相对照,用东北红豆杉和中国红豆杉的幼茎做外殖体,进行了愈伤组织诱导实验.发现改良SSS培养基对两种红豆杉幼茎均表现出95%以上的愈伤组织诱导率,且其增殖速度均一稳定.本文还用两阶段培养法研究了三种培养基对愈伤组织合成紫杉醇的影响.在愈伤组织增殖阶段,改良SSS栩RW培养基虽然表现出抑制作用,但是,在第二阶段有利于促进紫杉醇合成,而且改良SSS培养基对10-去乙酰浆果赤霉素Ⅲ、浆果赤霉素Ⅲ等紫杉醇类化合物的合成也有促进作用.在比较三种培养基的基本成分基础上,本文认为铵态氮含量是影响紫杉醇合成的重要因素之一.并将B5培养基中的大量元素减半与B5培养基进行对比实验,发现紫杉醇的含量得到大幅度提高,并且促进了生物量的积累,在1/2 B5培养基中,紫杉醇的总产量是B5培养基的9倍.另外,本文还比较了Gellan Gum和琼脂两种凝固剂对紫杉醇合成的影响,结果表明琼脂有利于紫杉醇的合成.

两种新紫杉烷类二萜化合物的研究

从云南红豆杉（ＴａｘｕｓｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓＣｈｅｎｇ ｅｔＬ．Ｋ．Ｆｕ）的树皮中分离鉴定了５ 种化合物。通过理化常数及ＩＲ、ＭＳ、１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲ分析，鉴定为７－表－紫杉醇Ｂ（Ⅰ）、１，１３－二乙酰基－１０－去乙酰基巴卡亭Ⅲ（Ⅱ）、紫杉醇Ｃ－７－木糖甙（Ⅲ）、紫杉醇（Ⅳ）和３－表－熊果酸（Ⅴ）。其中。

红豆杉罗汉松中紫杉烷类成分的含量分析

对红豆杉、罗汉松的叶、树皮、木质部等不同部位的乙醇提取物用氯仿萃取浸膏中的紫杉醇，巴卡亭Ⅲ，１０－去乙酰巴卡亭Ⅲ，三尖杉宁碱等４种紫杉烷同系物，用高压液相色谱进行含量分析．这对人工半合成抗癌活性成分紫杉醇寻找更多的前体物具有开拓性意义，对合理开发利用这些植物资源提供了科学依据．

从南方红豆杉中筛选和鉴定25株产紫杉烷的内生真菌

为从南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)中分离产紫杉烷的内生真菌,从其幼茎、树皮和叶片中分离纯化了491株内生真菌,经筛选获得25株内生真菌具有产紫杉烷的能力,其中,4株可产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,8株能产紫杉醇和巴卡亭Ⅲ,1株能产紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,1株能产巴卡亭Ⅲ和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ,6株仅产紫杉醇,5株仅产巴卡亭Ⅲ。根据内生真菌的来源,幼茎中有11株产紫杉烷的内生真菌,叶片中有9株,而树皮中仅有5株。这些菌株的紫杉醇、巴卡亭和10-去乙酰巴卡亭Ⅲ产量分别为0.64~9.87、0.48~3.42和0.20~1.00μg L^(–1)。因此,南方红豆杉中具有紫杉烷类代谢途径的内生真菌来源广,数量多,是研究真菌中紫杉烷类化合物代谢途径的良好材料,也为紫杉烷类抗癌药生产提供了潜在的真菌种源。

粤北南方红豆杉树皮的化学成分研究

从粤北南方红豆杉 (Taxuschinensisvar .mairei)树皮中应用超临界CO2 萃取和常压柱层析分离鉴定了3个紫杉烷类化合物 ,分别为taxinineE、taxol和baccatinⅢ。

HPLC法测定红豆杉中紫杉醇及同系物的含量

建立了HPLC法测定红豆杉枝叶中10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（简称10-DABⅢ）、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱和紫杉醇的含量。采用二种流动相系统分别测定南方红豆杉枝叶中四种成分，以较大极性的甲醇-水（43：57）流动相系统测定10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ，以乙腈-水-甲醇（27：44：29）为流动相测定三尖杉宁碱和紫杉醇，采用Nova—Pak C18反相柱，流速为1mL／min，柱温35℃，紫外检测波长为227nm。10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱和紫杉醇的线性范围（n=5）分别为0．01～0．5μg（r=0．9998），0．01～1μg（r=0．9999），0．015～0．5μg（r：0．9990），0．01～0．5μg（r=0．9992）；样品用丙酮和水浸提，体积比为60：40，回收丙酮后，用二氯甲烷萃取得到上述四种成分。本实验方法操作简便，结果准确，重现性好，可作为不同地区红豆杉的质量控制方法之一。