龙胜凤鸡TBX5基因克隆、生物信息学分析及过表达载体构建

试验旨在探究TBX5(T-box Transcription Factor 5)基因在有、无毛脚鸡品种不同组织中的表达模式,并对其进行克隆、生物信息学分析及过表达载体构建。利用QRT-PCR检测TBX5基因在有、无毛脚鸡不同组织中的相对表达量;通过PCR扩增获得TBX5的CDS序列,并利用生物信息学软件对其序列及蛋白结构进行分析;通过双酶切构建TBX5过表达载体并利用QRT-PCR检测TBX5过表达效率。结果表明,相比广西麻鸡(鳞片脚),TBX5基因在龙胜凤鸡(毛脚)胫部特异性高表达;龙胜凤鸡TBX5基因CDS区全长1566bp,共编码521个氨基酸,与参考序列相比,存在3处同义突变及1处错义突变(c.296A>G引起蛋氨酸变为丙氨酸);同源性分析表明龙胜凤鸡TBX5基因与其他禽类的同源性均在92.8%以上;TBX5蛋白属于不稳定亲水性蛋白,不存在跨膜结构域和信号肽,蛋白二级结构由α-螺旋、β-折叠、延伸链及无规则卷曲组成,三级结构主要由无规则卷曲及延伸链构成。本试验成功构建了pEGFP-TBX5过表达载体,QRT-PCR结果显示TBX5在过表达组极显著高于对照组。本研究结果为后续探究TBX5基因在鸡毛脚性状中的作用提供了理论基础。

LncRNA TUSC7通过调控miR-182/TBX5轴抑制 结直肠癌的增殖迁移和侵袭

目的:探讨长链非编码RNA抑癌候选基因7(long non-coding RNA tumor suppressor candidate 7,LncRNA TUSC7)通过调控微小RNA-182(microRNA-182,miR-182)/T-框蛋白5(T-box5,TBX5)轴对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)增殖、迁移和侵袭的影响。方法:实时荧光定量PCR检测LncRNA TUSC7、miR-182和TBX5在90对CRC腺癌组织及远端正常组织中的表达水平,通过临床样本数据分析三者的相关性,并检测LncRNA TUSC7在人CRC细胞系LoVo、SW1116、CaCO 2、HCT116和SW480以及正常人结肠粘膜细胞系NCM460中的表达。RNA荧光原位杂交实验检测LncRNA TUSC7的亚细胞定位。SW480细胞分10组,敲减TUSC7(shTUSC7)组和敲减对照(shNC)组、过表达TUSC7(oeTUSC7)组和过表达对照(oeNC)组、miR-182过表达(miR-182 mimic)组和过表达对照(NC mimic)组、干涉miR-182(miR-182 inhibitor)组和干涉对照(NC inhibitor)组、同时过表达TUSC7和miR-182(oeTUSC7+miR-182 mimic)组及同时过表达TUSC7、miR-182和TBX5(oeTUSC7+miR-182 mimic+oeTBX5)组,分别进行shTUSC7、shNC、oeTUSC7、oeNC、miR-182 mimic、NC mimic、miR-182 inhibitor、NC inhibitor转染及oeTUSC7+miR-182 mimic共转染和oeTUSC7+miR-182 mimic+oeTBX5共转染。CCK8、克隆形成、流式细胞术和Transwell实验测定LncRNA TUSC7、miR-182和TBX5对SW480细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。双荧光素酶报告基因系统实验、RNA免疫沉淀实验、RNA pull-down实验和Western blot验证LncRNA TUSC7、miR-182和TBX5的相互关系。Kaplan-Meier法进行生存分析。将裸鼠随机分为4组(n=12):shTUSC7组、shNC组、oeTUSC7组和oeNC组。分别于右侧腋窝内皮下接种shTUSC7、shNC、oeTUSC7、oeNC转染的SW480细胞。用于在体评价LncRNA TUSC7对CRC肿瘤生长的影响及生存分析。结果:与癌旁正常组织相比,在CRC组织中,LncRNA TUSC7(1.53±0.84 vs 6.97±3.97)和TBX5(0.58±0.29 vs 3.25±1.51)低表达而miR-182(0.54±0.33 vs 0.09±0.06)高表达(P<0.05),且LncRNA TUSC7与miR-182表达负相关(R2=0.09077)而与TBX5的表达正相关(R2=0.08371),miR-182与TBX5的表达负相关(R2=0.06914;P<0.05)。与NCM460(1.00±0.05)细胞相比,LncRNA TUSC7在LoVo(0.51±0.08)、SW1116(0.41±0.10)、CaCO 2(0.42±0.11)、HCT-116(0.53±0.10)和SW480(0.35±0.07)细胞中均显著低表达(P<0.05),且在SW480细胞中表达最低。LncRNA TUSC7定位在在CRC细胞质中表达。与shNC/oeNC组相比,沉默/过表达LncRNA TUSC7促进/抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭,而减少/增加细胞凋亡(P<0.05)。LncRNA TUSC7可直接靶向miR-182,此外,TBX5是miR-182的一个直接的靶点。从机制上讲,LncRNA TUSC7通过靶向miR-182促进TBX5的表达进而抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭并促进凋亡。与体外实验结果相一致,LncRNA TUSC7可在体抑制CRC肿瘤的生长。结论:LncRNA TUSC7在CRC组织和细胞中低表达,且LncRNA TUSC7通过调控miR-182/TBX5轴抑制CRC的增殖、迁移和侵袭。

葛根芩连汤调节lncRNA-TUSC7/miR-182/TBX5信号轴对结直肠癌发生发展的作用机制研究

目的探究葛根芩连汤调节lncRNA-TUSC7/miR-182/TBX5信号轴对结直肠癌(CRC)发生发展的作用机制。方法1)体外实验:将培养好的HCT-116细胞分为对照组、oe-NC组、oe-TUSC7组、inhibitor-NC组、miR-182 inhibitor组、oe-TUSC7+miR-NC组、oe-TUSC7+miR-182 mimic组。RTqPCR检测lncRNA-TUSC7、miR-182、TBX5 mRNA的表达;CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blotting检测细胞TBX5、Ki67、Caspase-9蛋白表达水平;双萤光素酶报告基因实验检测miR-182与lncRNA-TUSC7和TBX5的靶向关系。2)体内实验:皮下注射DMH建立大鼠CRC模型,将大鼠分为模型组、葛根芩连汤组、葛根芩连汤+LV-NC组、葛根芩连汤+LV-shTUSC7组,另设对照组(无处理)。测量肿瘤数量、质量和体积;RT-PCR检测肿瘤组织TUSC7、miR-182、TBX5 mRNA的表达;Western blotting检测TBX5、Ki67、Caspase-9蛋白表达。结果1)体外实验:与对照组和oe-NC组相比,oe-TUSC7组细胞中TUSC7、TBX5 m RNA表达、凋亡率、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著升高,miR-182表达、OD450值(24、48 h)、Ki67表达显著降低(P<0.05);与inhibitor-NC组相比,miR-182 inhibitor组细胞中TBX5 mRNA表达、凋亡率、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著升高,miR-182表达、OD450值(24、48 h)、Ki67表达显著降低(P<0.05);与oe-TUSC7+miR-NC组相比,oe-TUSC7+miR-182 mimic组细胞中TBX5 m RNA表达、凋亡率、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著降低,miR-182表达、OD450值(24、48h)、Ki67表达显著升高(P<0.05);双萤光素酶报告基因实验验证miR-182与TUSC7和TBX5存在靶向调控关系。2)体内实验:与对照组相比,模型组大鼠肿瘤数量、肿瘤质量和肿瘤体积、miR-182表达、Ki67蛋白表达显著升高,肿瘤组织中TUSC7和TBX5 m RNA表达、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,葛根芩连汤组大鼠肿瘤数量、肿瘤质量和肿瘤体积、肿瘤组织miR-182表达、Ki67表达显著降低,肿瘤组织TUSC7和TBX5 mRNA表达、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著升高(P<0.05);与葛根芩连汤组和葛根芩连汤+LV-NC组相比,葛根芩连汤+LV-shTUSC7组大鼠肿瘤数量、肿瘤质量和肿瘤体积、miR-182表达、Ki67表达显著升高,肿瘤组织中TUSC7和TBX5 m RNA表达、TBX5、Caspase-9蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论葛根芩连汤可能通过上调TUSC7,海绵化miR-182,从而促进TBX5表达,进而抑制CRC细胞的生长。

人类单纯性先天性心脏病中TBX5基因的突变及表达研究

应用PCR DGGE方法在61个单纯性先天性心脏病核心家系共216位成员中检测TBX5基因8个外显子的突变情况;以β actin作为内对照对单纯性先天性心脏病患者(房间隔缺损12例、室间隔缺损16例、法洛四联症6例)和3个非先天性心脏病患者(正常对照)心肌标本进行RT PCR扩增和定量分析,观察TBX5基因在mRNA水平有无差异。研究了人类单纯性先天性心脏病患者中TBX5基因突变及表达情况。在所有被检成员中,未发现突变;与非先天性心脏病患者(正常对照)相比,单纯性先天性心脏病患者TBX5基因mRNA表达呈下降趋势。通过本研究认为TBX5基因编码区突变不是人类单纯性先天性心脏病的致病原因,但其转录水平的异常可能是单纯性先天性心脏病的一种潜在致病机制。

单纯性先天性心脏病中TBX5基因表达异常的机制

为探讨人类单纯性先天性心脏病患者中TBX5基因表达下调的可能原因,应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法检测100例单纯性先天性心脏病患者中TBX5基因上游1200bp调控区的突变情况;应用甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)法检测50例单纯性先天性心脏病患者和5例非先天性心脏病患者心肌组织TBX5基因启动子区两个CpG岛(转录起始点上游-49～-188bp和-247～-464bp处)的甲基化情况;应用P-match软件预测小鼠Tbx5基因上游转录因子Nkx2-5的结合位点,构建Nkx2-5表达载体转染小鼠H9C2(2-1)心肌细胞,RT-PCR及Western blotting检测Tbx5基因表达,凝胶阻滞实验(EMSA)验证Nkx2-5和Tbx5基因的作用。结果在100例单纯性先天性心脏病患者中,未检测到TBX5基因上游1200bp调控区突变;非先天性心脏病患者和单纯性先天性心脏病患者在两个CpG岛存在相同的甲基化;小鼠Tbx5基因转录起始点上游-312～-315bp可能存在Nkx2-5的结合位点,转染Nkx2-5表达载体后Tbx5基因在mRNA及蛋白质水平均有表达增高趋势,Nkx2-5在体外可以与Tbx5基因上游-312～-315bp序列相结合。以上结果提示TBX5基因调控区突变和两个CpG岛的甲基化不是单纯性先天性心脏病患者心肌组织中TBX5基因表达下调的原因,TBX5基因表达下调可能由于NKX2-5的表达异常引起。

法乐四联症患儿NKX2.5、TBX5、GATA4基因的表达研究

目的:探讨NKX2.5、TBX5、GATA4基因与法乐四联症的发病关系及法乐四联症形成的分子机制。方法:10例法乐四联症患儿(法乐四联症组),为我院2005-06至2005-12心脏中心住院患儿。年龄4个月～8岁,平均3.5岁。6例非先天性心脏病(先心病)意外死亡患儿作为对照(对照组),均没有先心病病史和遗传病家族史。年龄4个月～9岁,平均年龄3.8岁。留取各病例右心室流出道心肌组织,提取心肌组织总RNA,逆转录为与RNA链互补的单链DNA(cDNA)。按照引物设计原则进行引物设计,用来扩增心肌组织NKX2.5、TBX5、GATA4、GAPDH mRNA目的片段。引物长度18bp～22bp,扩增片段长度163bp、206bp、237bp、203bp。应用双标准曲线、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法比较NKX2.5、TBX5、GATA4基因的mRNA含量在对照组和法乐四联症组之间的统计学差异。结果:法乐四联症组的NKX2.5mRNA含量较对照组显著降低,差异有统计学意义。TBX5mRNA和GATA4mRNA含量在法乐四联症组与对照组的差异无统计学意义。结论:人心肌组织中有心脏发育相关基因NKX2.5、TBX5和GATA4mRNA的表达;法乐四联症可能与心肌组织中NKX2.5mRNA含量降低相关。

心脏形成关键基因-TBX5在大鼠胚胎心脏中的克隆及表达研究(英文)

为了研究心脏形成关键基因-TBX5的表达情况,选择Wistar大鼠作为从分子水平研究心脏发育的实验动物并从胎鼠心脏中克隆了TBX5 cDNA全长(GenBank登录号:AY859491),其cDNA及氨基酸序列不同于GenBank预测序列;随后应用RT-PCR及Northern blot分析TBX5基因在大鼠各组织中的表达情况,发现TBX5为单一转录本,在大鼠各组织均有表达,心脏中表达最强;构建荧光表达载体,转染大鼠肝癌细胞,观察TBX5亚细胞定位,结果证实TBX5基因在细胞核中表达;最后构建原核表达载体,IPTG诱导表达获得了GST-TBX5融合蛋白。以上工作为进一步鉴定心脏发育中TBX5相关转录因子及研究相互间的调控机制奠定了基础。

TBX5基因rs3825214位点多态性和心房颤动的相关性

目的探讨TBX5基因多态性与心房颤动的相关性。方法房颤患者100例(房颤组)和非房颤患者(对照组)107例进行TBX5基因rs3825214单核苷酸多态性和房颤的关联研究。所有患者均采集外周血提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)检查患者TBX5基因rs3825214多态性的基因型和等位基因分布。结果 TBX5基因rs3825214位点在入选人群中存在多态性,分别为GG、AG和AA型,其基因型频率在房颤组和对照组分别依次为28.0%,60.0%,12.0%和15.9%,50.5%,33.6%。GG基因型在房颤组的频率分布显著高于对照组(P=0.035),AA基因型在房颤组的频率分布明显低于对照组(P<0.001)。G和A等位基因频率在房颤组和对照组分别为56.0%,44.0%和41.1%,48.9%,G和A等位基因频率在两组间的差异有统计学意义(P=0.001)。结论 TBX5基因rs3825214位点多态性与房颤的发生有相关性,G等位基因可能是房颤的易感基因,GG基因型可能增加了房颤发生的危险性。

TBX5基因在心脏发育中的作用

近年来 ,国内外学者对控制心脏发育的相关基因做了大量的研究工作 ,其中转录因子在心脏发育中的作用成为研究热点。 TBX5转录因子在早期心脏发育 ,尤其是在心房和左心室的发育中起着关键的不可替代的作用。本文从结构特征、在心脏发育中的作用及可能的作用机制几方面对

6例心手综合征患者TBX5基因突变分析

目的对国内心手综合征(HOS)患者进行临床调查分析和TBX5基因突变检测,评价中国HOS患者中TBX5基因的突变情况与临床表型的关系。方法分别对6例来自广东省不同家系的HOS患者进行临床资料的收集;从静脉血提取HOS患者基因组DNA,通过PCR扩增和DNA直接测序法对TBX5基因进行g DNA序列突变检测,再通过生物信息学软件GENETOOL及BLAST对序列结果与Genbank标准序列进行对比,进一步分析TBX5基因突变与临床表型的关系。结果发现3个HOS患者存在TBX5基因外显子序列突变:1个HOS患者为TBX5基因单个碱基缺失导致移码突变,2个心脏HOS患者为TBX5基因碱基替换导致错义突变。结论TBX5基因突变可能是中国HOS患者的发病原因之一,但突变特点具有随机性,基因突变类型与临床表型未发现明显相关性。

TBX5及其网络分子与室间隔发育的相关性

TBX5是一种转录因子,在心脏发育过程中起着重要作用。TBX5转录时点的变化将会导致室间隔发育异常,TBX5-Sall4-Nppa环的网络作用对室间隔的初发、定位有重要意义。Hey2属TBX5的下游调控基因之一,它的表达和TBX5类似,呈现出左侧梯度,故它在室间隔的发生中也有一定的作用。TBX20和TBX5同属T-box家族成员,这两者在表达的方式上呈现类似镜像的关系——一个主要表达于右室,另一个则主要表达于左室,两者的表达界点及相互作用也与室间隔的发生有关。

TBX5基因在人类单纯性先天性心脏病中的突变及表达研究

目的 研究人类单纯性先天性心脏病患者中TBX5基因突变及表达情况。方法 应用PCR—DGGE方法在61个单纯性先天性心脏病核心家系共216位成员中检测TBX5基因7个外显子的突变情况；以β—sctin作为内对照对10个房间隔缺损患者和2个非先天性心脏病患者(正常对照)心肌标本进行RT—PCR扩增和定量分析，以观察TBX5基因在mRNA水平有无差异。结果 在所有被检成员中，未发现突变：与非先天性心脏病患者(正常对照)相比，房间隔缺损患者TBX5基因mRNA表达呈下降趋势。结论 TBX5基因编码区突变不是人类单纯性先天性心脏病的致病原因，但其转录水平的异常可能是单纯性先天性心脏病的一种潜在致病机制。

特发性心房颤动相关TBX5基因新突变的识别

目的:识别特发性心房颤动(房颤)相关TBX5基因新突变。方法:入选特发性房颤患者116例及健康对照者200名,获取临床资料和外周静脉血标本,抽提全部研究对象的基因组DNA,扩增TBX5基因的全部编码外显子及其侧翼内含子,对扩增片段进行测序以寻找变异。检索PubMed和SNP数据库以明确所发现基因变异的新颖性。应用MUSCLE软件分析多物种TBX5蛋白,以显示被改变氨基酸在进化上的保守性,并应用在线程序MutationTaster和PolyPhen-2分析基因变异的致病性。结果:在1例家族史阴性的特发性房颤患者发现了1个TBX5基因变异,其TBX5基因编码核苷酸序列第314位的腺嘌呤变成了胸腺嘧啶(c.314A>T),所编码蛋白的氨基酸序列第105位的天冬氨酸变成了缬氨酸(p.D105V)。该突变不存在于200名对照者,也不存在于PubMed和SNP数据库中。多序列比对分析显示第105位的天冬氨酸在进化上完全保守。在线程序分析表明所识别的基因变异具有致病性。结论:发现了1个特发性房颤相关TBX5基因新突变,提示TBX5基因突变可能是特发性房颤的少见遗传病因。

转录因子TBX5及其与先天性心脏病致病性关系的研究进展

先天性心脏病是一类在胎儿时期心脏血管发育异常所致的心血管畸形。先天性心脏病的致病性与转录因子TBX5的关系非常密切。TBX5作为T-box转录因子家族成员之一,以其在心脏和前肢发育中的作用而得到广泛关注。TBX5突变可以引起先天性房间隔缺损、室间隔缺损和其他心脏传导系统异常,还可以引起以上肢和心脏畸形为特征的心手综合征。心脏基因的正常表达主要通过TBX5的网络调节,其中TBX5激活和抑制作用任一过程失调都将会导致先天性心脏病的发生。

先天性房间隔缺损相关TBX5基因新突变研究

目的:研究先天性房间隔缺损(ASD)相关TBX5基因新突变。方法:从中国汉族人群入选62例ASD患者和108名健康对照者,提取基因组DNA。对全部研究对象的TBX5基因的整个编码区进行测序分析以发现新的致病突变。构建野生型及突变型TBX5的真核表达载体,利用脂质体转染COS-7细胞,同时转染报告质粒心房利钠因子-荧光素酶及内对照质粒,应用双荧光素酶报告基因分析试剂研究突变型TBX5的转录活性。结果:在1例散发型ASD患者中发现了1个杂合性TBX5基因新突变,即c.318C>G(p.Y106X)突变。该无义突变不存在于108名健康对照者。功能分析表明突变型TBX5对靶基因的转录激活功能丧失。结论:发现1个ASD相关TBX5基因功能缺失性新突变,对ASD的个体化防治具有潜在的临床意义。

利用切片免疫荧光技术研究Tbx5在小鼠胚胎心脏中的表达

Tbx5参与转录因子的调控,对上肢及心脏发育起关键作用.通过对小鼠胚胎心脏组织切片厚度的选择、加入抗原修复液等试验条件的优化,建立了利用切片免疫荧光技术检测小鼠胚胎心脏中Tbx5的方法.结果显示,在胚胎发育的第11.5 d,Tbx5在整个心脏中都有表达,尤其在心房以及左心室中高表达.但在胚胎发育的第13.5 d,Tbx5只在心房和左心室中表达,在右心室中并不表达.揭示Tbx5的这种动态表达模式对于心脏的发育以及腔室分化是十分重要的.

TBX5基因靶序列单核苷酸多态性与先天性心脏病的关系

目的探讨TBX5基因3'非翻译区靶序列SNPs与先天性心脏病(CHD)遗传易感性的关系,为CHD的分子机制研究提供线索。方法利用HaploView软件筛选TBX5基因3'非翻译区功能性单核苷酸多态性(SNP),并应用高分辨率熔解曲线检测TBX5基因3'非翻译区SNP。采用病例对照研究分析SNP位点与CHD的关联。结果HaploView软件筛选出TBX5基因3'非翻译区有意义的标签SNP rs883079,高分辨率熔解曲线法成功检测该SNP位点(rs883079)的G/G、G/A及A/A 3种基因型。TBX5基因rs883079(G>A)位点等位基因或基因型分布频率比较,差异有统计学意义(P<0.05);与CHD易感性关联,A是CHD的危险等位基因,A/A为CHD的危险基因型(P<0.05)。结论TBX5基因rs883079位点SNP与CHD有关系,rs883079(G>A)携带突变纯合子基因型A/A个体患CHD的危险性升高。

房颤相关TBX5基因单核苷酸多态性临床意义

目的了解房颤与TBX5基因单核苷酸多态性(SNP)的关联性。方法选取房颤患者92例及无房颤患者(对照组)93例,提取外周血基因组DNA,行TBX5基因rs3825214位点的SNP检测。结果 TBX5基因rs3825214位点呈多态性表现(AA、AG和GG型),房颤组和对照组基因型分布差异有统计学意义(P<0.05);房颤组等位基因以G为主,对照组等位基因以A为主(P<0.05);TBX5基因SNP对房颤发生有影响(P<0.05)。结论房颤与TBX5基因rs3825214位点多态性相关,GG基因型人群房颤发生率可能增高,G等位基因或为房颤易感基因。

Nkx2.5、GATA4和TBX5基因在先天性心脏病中表达的研究

探究Nkx2.5、GATA4及TBX5基因在先天性心脏病患儿中的表达情况。方法:本院于2018年9月~2020年9月纳入16例先天性心脏患儿(甲组)开展研究。另抽取意外死亡的15例非先天性心脏小儿心肌组织标本(乙组)作为对照;对患儿心肌组织内RNA进行提取,比较两组患儿Nkx2.5、GATA4及TBX5基因表达情况。结果:甲组患儿心肌组织内Nkx2.5、GATA4及TBX5基因表达情况与乙组相比存在显著差异(P<0.05)。结论:先天性心脏病患儿存在Nkx2.5、GATA4及TBX5基因异常表达情况,通过对这些基因表达情况进行测定一定程度上可用于临床疾病诊断。

先天性心脏病相关TBX5突变的研究进展

先天性心脏病(congenital heart diseases,CHDs)严重影响人类健康,遗传因素与CHDs的发生密切相关。在辅助生育过程中,利用极体活检、卵裂球活检和囊胚活检等方法,结合单细胞DNA扩增及高通量测序技术,能够准确检测出着床前胚胎中与单基因遗传疾病相关的致病突变。T盒转录因子5(T-box transcription factor 5,TBX5)是心脏和上肢发育的重要转录因子,已报道有227种TBX5突变与CHDs相关。通过植入前单基因遗传病检测(preimplantation genetic testing for monogenic disease,PGT-M),检测胚胎中是否存在CHDs相关性TBX5突变,对于预防CHDs的发生有重要意义。本文系统整理了已报道的TBX5突变相关信息,并结合家族性遗传数据、动物模型、诱导多潜能干细胞疾病模型和预测软件,对TBX5错义突变进行了综合分析,以期为CHDs相关TBX5突变的PGT-M提供参考。