靶向HER2的CAR T细胞构建与对膀胱癌细胞杀伤活性的探索研究

目的制备特异性杀伤人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)表达阳性的膀胱癌细胞的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-Cell,CAR T),初步探索HER2-CAR T细胞治疗膀胱癌的可行性。方法首先免疫组化法检测膀胱癌患者石蜡组织切片中肿瘤细胞HER2表达情况,然后以赫赛汀单克隆抗体的单链抗体(single chain antibody fragment,scFv)序列作为CAR T的识别序列,构建包含铰链,共刺激分子(CD28和4-1BB胞内域)和CD3z的三代CAR T慢病毒质粒。使用293T细胞包装慢病毒,感染人源外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)细胞,制备HER2-CAR T细胞,并采用流式细胞术检测CAR的转导效率。将CAR T细胞分别与HER2表达阳性并且稳转构建表达荧光素酶的SK-BR3阳性对照细胞和MDAMB-468阴性对照细胞及T24膀胱癌细胞共培养,采用荧光素酶报告基因检测法检测杀伤效果,利用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定CAR T细胞与癌细胞共孵育时干扰素(Interferon gamma,IFN-)的分泌水平。结果免疫组化法检测显示多数膀胱癌患者的病理组织高表达HER2。免疫荧光和流式细胞荧光分选技术(fluorescence-activated cell sorting,FACS)显示T24膀胱癌细胞高表达HER2。流式细胞术检测显示T细胞的CAR转导效率为69%,体外共培养实验显示CAR T细胞与T24细胞比为5:1时,杀伤效率达到73%。CAR T细胞对SK-BR3细胞和T24细胞具有较强毒性,但是对于MDA-MB-468阴性对照细胞仅在高效靶比时有较弱杀伤,显示了HER2-CAR T细胞杀伤的特异性。共孵育时,SK-BR3组培养基上清中INF-浓度达到319 pg/mL,T24组培养基上清中INF-浓度为275 pg/mL。结论成功制备靶向杀伤HER2阳性膀胱癌细胞的CAR T细胞,为CAR T细胞治疗膀胱癌提供了初步的研究支持。

复发性口疮病灶γδT细胞增多及其临床意义

为探明复发性口疮患者局部病灶单个核细胞有否免疫激活或免疫缺陷，通过三色免疫荧光染色技术结合流式细胞仪活细胞分析技术，检测研究对象的淋巴细胞表型，复发性口疮（ＲＡＵ）活动期患者４１例作为研究组，无ＲＡＵ病史的口腔粘膜外伤３５例作为对照组。结果显示，ＲＡＵ活动期患者γδＴ细胞数量（平均９．０％）明显高于对照组（平均３．０％，Ｐ＜０．００１）。实验表明患者在发作期存在免疫刺激，但刺激物的本质尚未明确，巨细胞病毒和带状疱疹病毒可能涉及这一免疫刺激过程。

急性乙肝患者HBV特异性CD8T细胞受体基因的克隆分析

目的探讨急性乙肝患者HBV特异性CD8 T细胞受体（TCR）参与免疫应答的分子机制。方法分离HLA-A2阳性急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMCs）,用荧光标记的CD3、CD8抗体和五聚体染色,流式细胞仪检测HBsAg183-191和HB-sAg335-343特异性CD8 T细胞频率。取6例患者PBMCs,用HBsAg335-343表位多肽诱导培养34周,用磁珠分选出CD8 T细胞后再用流式细胞术分选HBV特异性CD8 T细胞,经IL-2/CD3抗体/CD28抗体扩增后提取细胞mRNA,用cDNA5′末端快速扩增技术获取TCR分子α链和β链全长可变区基因片段并进行克隆和测序,每个样本的克隆测序数≥50个。确定TCRα、β链基因家族并比较CDR3区序列特点。结果 6例患者样本600多个TCRα、β链克隆基因序列分析结果表明,HBV特异性CD8 T细胞均呈现TCR分子α、β链基因家族优势表达特点,每例患者样本以24种α链和14种β链家族为主,其中α2、α14、α15、β3、β13和23链家族同时出现在1例以上患者,有1例患者所有克隆分析的β链基因均为β13家族。同一患者同一家族α、β链CDR3区序列趋于一致,而不同患者同一家族α、β链CDR3区序列相差较大。结论经HBV抗原表位多肽诱导增殖的特异性CD8 T细胞具有明显的TCRα、β链取用优势特点,这种TCR链的优势表达特点可能是影响抗HBV感染特异性细胞免疫力的重要分子基础。

健脾解毒方对脾虚肝癌大鼠生存的影响及与TCR、ERK1/2信号通路的关系

目的探讨健脾解毒方对脾虚肝癌大鼠生存的影响及与TCR、ERK1/2、p-ERK1/2的关系。方法 105只Wistar大鼠脾虚肝癌模型组,进行造模和干预。随机分为空白对照组(A组),肝癌模型组(B组),脾虚对照组(C组),脾虚肝癌模型组(D组),健脾解毒方低浓度E组、高浓度F组及胸腺五肽组(G组)。实验中记录动物的体质量、生存时间、肝癌大鼠濒死状态时恶液质积分并采集标本。Western blot方法检测大鼠肝组织、肝癌组织、T淋巴细胞中TCR蛋白表达,以及T淋巴细胞中ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达。结果健脾解毒方高浓度组和胸腺五肽组大鼠终末期体质量、累积生存率高于脾虚肝癌模型组及肝癌模型组(P <0. 05),终末期恶液质积分则更低(P <0. 05)。健脾解毒方高浓度组大鼠肝组织、癌组织中TCR蛋白表达量,外周T淋巴细胞中TCR蛋白、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表达量均较脾虚肝癌模型组明显增加(P <0. 05)。结论高浓度健脾解毒方能延缓荷瘤鼠恶液质的发生和进展,明显延长荷瘤鼠生存时间,其作用可能与健脾解毒方上调TCR、ERK1/2及p-ERK1/2有关。

肾综合征出血热患者NK细胞及其表面标志物的动态观察

通过动态观察肾综合征出血热患者不同临床阶段NK细胞及CD8+T细胞表面活化性/抑制性受体等分子的变化,探讨患者抗汉坦病毒感染的免疫机制,为本病的抗感染免疫治疗提供科学依据。收集肾综合征出血热患者血液样本57份,以健康人血做对照,用流式细胞仪检测各组样本NK细胞数及NK细胞亚群、NK细胞活化及抑制受体、CD8+T细胞数及其表面NK受体的表达水平。分析患者的发热期、少尿期、多尿期和恢复期上述观察指标的动态变化。结果显示,肾综合征出血热患者的NK细胞水平明显高于正常对照组(P<0.001)。患者的发热期、少尿期、多尿期和恢复期4个不同临床过程中NK细胞水平都处于升高状态,其中少尿期高于其他各期(P<0.01)。患者NK细胞抑制受体NKG2A表达总水平有下降趋势,在少尿期下降的比较明显(P<0.01),NK细胞活化受体NKG2D表达呈上升的趋势,不同病程中表达总体水平基本一致。患者的NK细胞亚群CD56^-CD16^+和CD56^(bri)CD16^(-/+)数量显著高于正常对照组(P<0.01),而CD56^(dim)CD16^+细胞NK亚群变化无统计学差异(P>0.05)。患者CD8^+T细胞总数及病程各期均显著高于对照组(P<0.01);病例组和对照组CD8^+T细胞表达NK活化受体NKG2D和抑制受体NKG2A无显著差异(P>0.05)。结果表明,肾综合征出血热患者的急性期NK细胞处于活化状态;其中CD56^(bri)CD16^(-/+)NK细胞亚群及CD56-CD16^+NK细胞在免疫调节方面发挥了重要的作用。

过敏性紫癜患儿外周血SIL-2R和T细胞亚群变化的临床意义

目的 探讨过敏性紫癜患儿外周血SIL - 2R和T细胞亚群变化的临床意义。方法 采用双抗体夹心法ELISA法测定过敏性紫癜 (HSP)患儿外周血可溶性白细胞介素 - 2受体 (SIL - 2R)水平 ,同时用McAb法检测T细胞亚群。结果 急性期HSP患儿血清SIL - 2R水平较对照组和缓解组明显提高 (P分别 <0 .0 1和 0 .0 5 ) ,缓解组SIL - 2R虽有所下降但仍明显高于对照组 (P <0 .0 5 ) ,并且HSP急性期患儿CD3、CD4 、CD8均显著低于对照组 (P分别 <0 .0 1和 0 .0 5 ) ,而在缓解组CD3、CD4 、CD8均向正常方向转化 ,但仍然偏低。由于CD4 、CD8的变化比例不同 ,结果导致CD4 、CD8比例明显升高 (P <0 .0 5 )。结论 SIL - 2R和T细胞亚群可作为HSP诊断、病情监测及预后判断的参考性指标。

急性淋巴细胞白血病T细胞受体δ基因不完全重排的研究

应用ＤＮＡ多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术对急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）进行了Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）δ基因重排的研究，并获得了３个ＡＬＬ患者ＴＣＲδ基因的Ｖ－（Ｄ）－Ｄ结合部顺序（Ｎ顺序）。证明ＡＬＬ，特别是Ｂ细胞ＡＬＬ中，ＴＣＲδ基因不完全重排的发生率比较高，最常见的两种重排类型为Ｖδ＿２－（Ｄ）－Ｄδ＿３和Ｄδ＿（１／２）～Ｄδ＿３。δ基因的不完全重排是早期淋巴分化调控中一个重要的内容。δ基因Ｖ－（Ｄ）－Ｊ结合部的Ｎ顺序具有高度的特异性，可作为检测ＡＬＬ微小残留病变的特异性克隆标志。

急性淋巴细胞白血病中T细胞受体δ基因Vδ2－Dδ3及Dδ2－Dδ3重排结合部顺序的研究

为了探讨中国人Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）δ基因的Ｖ－Ｄ－Ｊ结合部顺序（Ｎ顺序）的组成，及其在急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）患者中的重组规律，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）对４６例ＡＬＬ标本进行了ＴＣＲδ基因重排的研究，发现１６例患者出现Ｔ细胞受体δ基因不完全重排，其中１３例为Ｖδ２－（Ｄ）－Ｄδ３重排，３例为Ｖδ２－（Ｄ）－Ｄδ３合并Ｄδ２－Ｄδ３重排。进而应用ＤＮＡ直接测序技术，对这１６例ＡＬＬ标本ＴＣＲδ基因重排结合部进行了分析，证实由于Ｖδ２或Ｄδ２的３＇端和Ｄδ３的５＇端碱基缺失、部分Ｄδ１或Ｄδ２顺序存在、Ｎ顺序的插入以及未发生缺失的Ｖδ２，Ｄδ２或Ｄδ３编码顺序端Ｐ核昔酸的非随机插入，使得每例患者的结合部顺序均存在高度个体特异性。此外，对Ｎ顺序碱基成份的分析表明，其脱氧鸟嘌呤和脱氧胞嘧啶含量大于７０％，而脱氧腺嘌呤和脱氧胸腺嘧啶小于３０％，说明碱基插入并非完全随机。本文结果提示ＴＣＲδ基因重排是淋巴细胞发育中的一个早期事件，其结合部顺序的测定，可作为检测ＡＬＬ患者微小残留病变的特异性克隆标志。

CD19-CAR-T和CD19-CAR-CIK细胞对表达CD19+K562细胞株杀伤作用的比较

目的 CAR-CD19-CIK和CAR-CD19-T效应细胞在体外对表达CD19的K562稳定细胞株杀伤能力和杀伤特异性的比较。方法效应细胞的构建是以通过基因合成和分子克隆手段构建CAR-CD19片段,以酶切的方法将CAR-CD19片段插入到慢病毒载体上;分离获得同一个健康志愿者外周血单核细胞,一部分加IFN-γ、重组人IL-1α、CD3单克隆抗体、重组人IL-2等细胞因子诱导CIK细胞产生;另一部分体外分选CD3阳性T细胞,CAR-19慢病毒同时感染CIK细胞和T细胞,采用流式细胞术检测转导效率和细胞分型;CD19+的靶细胞是由装载CD19基因表达的慢病毒载体转导K562细胞系,通过抗菌素的压力选择而构建;乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测CAR-CIK细胞和CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效率,炎性因子检测(CBA)法检测由CAR-CIK细胞和CAR-T细胞的细胞因子的分泌水平。结果同一CD19-CAR慢病毒载体在相同转导条件下,对原代CIK细胞的转导效率是60.5%,对原代T细胞的转导效率是36.2%;当效靶比5:1、10:1和20:1在这三种比例时,CAR-19-CIK细胞对CD19-K562细胞的杀伤效率分别为14.65%、33.08%和42.5%,对K562细胞的杀伤效率分别为8.3%、10.1%和24.9%;而CAR-19-T细胞对CD19-K562细胞的杀伤效率分别为17.22%、26.52%和32.49%,对k562细胞的杀伤效率分别为0.1%、3.6%和10.3%。结论 CAR-19-CIK细胞的杀伤作用明显强于CIK细胞;CAR-19-T细胞杀伤特异性比CAR-19-CIK细胞强。本研究对CAR-T和CAR-CIK免疫细胞治疗血液肿瘤的新策略和新临床方案设计提供了有意义的实验数据。

5例前列腺癌T细胞受体β链CDR3的多样性分析

T淋巴细胞受体(TCRs)在抗原识别免疫应答中作用重要,其多样性与宿主免疫反应及肿瘤预后判断密切相关。目的:采用高通量测序技术研究前列腺癌组织和癌旁组织中T细胞受体(TCR)克隆多样性及其克隆序列。方法:收集5例PC患者的癌组织和癌旁组织,提取DNA后经多重PCR技术对TCRβ链CDR3区进行扩增。用Illumina MiSeq进行测序,经过数据处理和比对分析,比较前列腺癌组织TCR CDR3组库的组成特征。结果:前列腺癌组织具有更高程度的克隆百分比和较高的高度扩增克隆比HEC(HEC:频率>样本总读数的0. 5%的TCR克隆),并获得了24对在癌组织样本中差异表达的V-J基因组合、16对在癌旁组织样本中差异表达的V-J基因组合。结论:前列腺癌组织与癌旁组织均存在差异性的V-J基因组合以及高克隆表达的HEC,其中癌组织样品具有更高的HEC。PC发生发展对免疫学研究提供了新的数据,对PC免疫监视、T细胞受体变异标志等研究提供了参考,对以后继续研究打下了基础。

嵌合抗原受体T细胞治疗实体肿瘤的进展与挑战

近年来，嵌合抗原受体T细胞（CAR—T）技术的发展使肿瘤免疫治疗成为生物治疗领域热点。CAR—T可识别肿瘤细胞表面抗原、靶向裂解肿瘤细胞。以CD19为代表CAR—T在血液系统肿瘤治疗中取得成功。然而其在实体肿瘤中的应用仍面临巨大挑战。与血液系统肿瘤比较，实体肿瘤微环境更复杂，肿瘤特异性抗原筛选难度大。回输的CAR．T由血液系统浸润至肿瘤局部，需克服肿瘤基质细胞屏障。尽管部分CAR—T可浸润至肿瘤细胞内，但T细胞功能很快被抑制。笔者综合分析现有研究结果，从实体肿瘤抗原特异性、实体肿瘤抗原异质性、CAR—T靶向肿瘤部位以及肿瘤微环境对CAR—T治疗的抑制作用等方面重点探讨影响实体肿瘤CAR—T疗效的免疫抑制因素及其可能的解决方法。笔者相信，以基因工程为代表的生物技术发展必将为优化CAR—T结构和功能提供更为丰富的技术手段，实体肿瘤CAR—T治疗必将取得突破性进展。

多色流式细胞术检测微小残留病变在CD19-CAR-T桥接allo-HSCT治疗B-ALL患者监测的意义和价值

目的探讨多色流式细胞术(MFC)监测微小残留病变(MRD)在CD19嵌合抗原受体T细胞(CD19-CAR-T细胞)治疗后桥接异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗难治、复发急性B淋巴细胞白血病(r/r B-ALL)患者过程中的意义和价值。方法收集2019年1月至7月河北燕达陆道培医院收治的r/r B-ALL患者37例,年龄15(6,19)岁,其中男24例,女13例,均为经CD19-CAR-T细胞免疫治疗桥接allo-HSCT治疗的患者。采用多色流式细胞技术以胞浆CD79a抗体设B细胞门监测患者在CART治疗前第0天、治疗后第15天、第28天及移植后骨髓、脑脊液样本、组织样本的MRD值评估肿瘤细胞残存以及肿瘤累及位置,监测CD19阳性B细胞在移植前恢复情况及CD19阳性B细胞恢复距离CAR-T细胞回输天数评估CAR-T细胞实际杀伤效果,同时进行患者各时间点外周血CAR-T细胞计数等。采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验分析单因素累积生存差异。结果(1)37例患者中8例死亡,29例存活。5例患者移植后复发,其中复发患者4例死亡,1例存活。(2)死亡组患者在CAR-T细胞免疫治疗后到桥接移植前MFC-MRD阴性缓解率为5/8,低于存活组28/29(χ^(2)=7.540,P=0.006);回输第15天阴性缓解率为3/8,低于存活组24/29(χ^(2)=6.512,P=0.011);回输第28天阴性缓解率为3/8,低于存活组26/29(χ^(2)=10.065,P=0.002)。而死亡组伴髓外MFC-MRD阳性肿瘤浸润率为(7/8)高于存活组(14/29)(χ^(2)=3.931,P=0.047)。CAR-T细胞免疫治疗后,死亡组CD19阳性细胞恢复时间即CAR-T细胞可对CD19阳性细胞杀伤时间42.00(30.00,49.00)d短于生存组55.00(41.50,73.50)d(Z=0.022,P=0.020)。结论利用多色流式细胞术检测B-ALL患者微小残留病变发现,在CD19-CAR-T细胞免疫治疗后到桥接allo-HSCT前、回输第15天、回输第28天等时间点,阳性结果均提示预后不良。这一结果为临床进行对症治疗提供一定指导意义。