西番莲3种病毒多重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】西番莲是一种具有很高经济价值的热带和亚热带水果,但无性繁殖方式导致病毒病成为西番莲产业发展的严重威胁。为了更好地监控田间西番莲病毒病的发生,特开展本研究,以期建立针对西番莲夜来香花叶病毒(telosma mosaic virus,TeMV)、东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV)和黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)的多重RT-PCR检测方法。【方法】根据已在GenBank上登记的3种病毒CP基因的保守序列,分别设计了针对TeMV、EAPV和CMV的3对特异性检测引物,通过试验确定了引物浓度、循环数、退火温度等条件,从而获得优化的多重RT-PCR反应体系,并验证了多重RTPCR的检测灵敏度,然后应用优化体系对广西田间采集的40个西番莲叶片样品进行3种病毒的检测。【结果】通过优化筛选,在20μL的PCR反应体系中实现了西番莲TeMV、EAPV、CMV 3种病毒的多重检测,最优反应条件是引物体积TeMV和EAPV各2μL、CMV3μL,循环数35次,退火温度54.9℃;验证结果表明,检测灵敏度最高可达10^(4)拷贝/μL。检测结果表明,3对特异性检测引物的扩增产物大小分别为496 bp、279 bp、157 bp。对西番莲叶片样品病毒进行检测的结果表明,TeMV、EAPV和CMV的检测结果分别是97.5%(39/40),95%(38/40)和2.5%(1/40),而用单一RT-PCR的检测结果分别是100%(40/40),95%(38/40)和2.5%(1/40),多重RT-PCR检测结果和单一RT-PCR检测结果的符合度为99.16%(119/120)。同时,TeMV和EAPV倾向于复合侵染,其复合侵染率高达95%(38/40)。【结论】本研究建立了西番莲病毒多重RT-PCR检测的优化体系,能够同时快速、灵敏和可靠地检测TeMV、EAPV和CMV,为这3种西番莲病毒田间控制、检疫规划和诊断提供了基础。

三种百香果病毒在贵州的发生分布

前期利用高通量测序鉴定了侵染贵州百香果的3种病毒,为了解其分布情况,本研究采集贵州省镇宁县、贞丰县、关岭县和罗甸县4个百香果主产区疑似感病样品105份,利用RT-PCR方法检测病毒分布情况。结果表明,该方法扩增产物清晰,且特异性和灵敏度较高。夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,TeMV)检出率最高,为100%;东亚西番莲病毒(East Asian passiflora virus,EAPV)和西番莲潜隐病毒(Passiflora latent carlavirus,PLV)检出率分别为81.9%和74.3%。说明贵州4个主产区的百香果均受到不同程度的病毒侵染,且部分地区病毒侵染情况严重。

侵染西番莲的夜来香花叶病毒的分子鉴定及特异性检测

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异性RT-PCR检测方法;序列测定结果利用BLAST程序和DNAMAN软件进行比对,同时对获得的CP基因序列采用Mr Bayes软件的贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建系统发育树并进行系统发育分析。【结果】血清学检测发现,一株表现有花叶、皱缩症状的西番莲样品与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用抗体反应呈阳性;电镜观察结果表明,该株疑似带毒样品中含有大小约750 nm×12 nm的弯曲线状病毒粒子;Potyvirus通用简并引物RT-PCR从该样品中扩增到一条与预期大小相符的目的片段,克隆、测序获得长度为680 bp的序列,该序列与已报道的Te MV核苷酸序列一致性最高(98.2%)。特异性引物扩增获得的CP基因序列全长为816 bp(命名为BXGFJ-13分离物),与已报道的Te MV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系统发育分析结果表明,13个Te MV分离物共形成3个类群,相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出很强的地理和寄主特异性。本研究获得的BXGFJ-13分离物与中国广西分离物(KJ789129)先以较高的后验概率聚为一个分支,再与泰国2个分离物(AM409188、AM409187)聚为第2类群(Group II),表明其在系统发育关系上与中国广西分离物的亲缘关系最近。利用特异性引物Te MV-CPf/Te MV-CPr建立的RT-PCR方法,具有良好的特异性,仅能从感染Te MV的西番莲样品上扩增出目的片段,而从黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus,Bt MV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)等其他病毒样品及阴性对照上均未扩增出目的片段。灵敏度测定结果显示,该方法能从稀释102倍的RNA上扩增出目的片段。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒不同成员的分类标准,同时结合血清学检测、电镜观察结果,证实福建果园表现花叶、皱缩症状的西番莲上携带有Te MV;建立的特异性RT-PCR方法能够用于Te MV的快速检测。