微小RNA-128-3p通过调控锌指盒同源结合蛋白1抑制卵巢癌细胞上皮-间充质转化

目的 探讨微小RNA(miR)-128-3p对卵巢癌细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响及其对锌指E盒同源结合蛋白1(ZEB1)的调控机制。方法 通过Real-time PCR技术检测上皮性卵巢癌组织(EOC)及癌旁正常组织(各30例)中miR-128-3p的表达量并观察其是否存在差异;选取2种人卵巢癌细胞系SKOV3和A2780,分别转染miR-128-3p模拟物(miR-128-3p mimic)组和阴性对照模拟物(NC mimic)组,利用Real-time PCR技术检测4组miR-128-3p的表达量并验证干扰效果,用Transwell实验观察4组细胞的迁移及侵袭能力。通过双荧光素酶实验验证miR-128-3p与ZEB1的调控关系,用Western blotting检测过表达miR-128-3p后ZEB1蛋白的表达水平;在SKOV3和A2780细胞系中转染pcDNA-ZEB1使其过表达ZEB1,分为NC mimic组,miR-128-3p mimic组,miR-128-3p mimic+pcDNA-ZEB1组,用Western blotting检测6组细胞中EMT相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(vimentin)的表达水平。结果 Real-time PCR结果显示,与癌旁组织相比,miR-128-3p在EOC组织中表达下降(P<0.01);miR-128-3p mimic组miR-128-3p相对表达量高于NC mimic组,而迁移细胞数量、侵袭细胞数量低于NC mimic组(P<0.01)。双荧光素酶实验结果显示,miR-128-3p对ZEB1存在负向调控作用。SKOV3、A2780细胞中miR-128-3p mimic组的ZEB1蛋白相对表达量均低于NC mimic组,而E-cadhein的蛋白相对表达量均高于NC mimic组(P<0.01)。MiR-128-3p mimic+pcDNA-ZEB1组E-cadhein的蛋白相对表达量低于miR-128-3p mimic组(P<0.01)。SKOV3、A2780细胞中miR-128-3p mimic组vimentin的蛋白相对表达量低于NC mimic组,miR-128-3p mimic+pcDNA-ZEB1组vimentin的蛋白相对表达量高于miR-128-3p mimic组(P<0.01)。结论 MiR-128-3p在上皮性卵巢癌组织中表达下降,其原因可能是通过调控ZEB1影响EMT相关蛋白表达而参与卵巢癌细胞EMT过程。

卵巢癌组织锌指E盒同源结合蛋白1、微小RNA-574-3p的表达及其临床意义研究

目的探究卵巢癌组织锌指E盒同源结合蛋白1(ZEB1)、微小RNA-574-3p(miR-574-3p)表达水平与患者临床病理特征及预后的关系。方法选取2015年1月至2018年1月于浙江医院行手术治疗的90例卵巢癌患者的癌组织作为卵巢癌组,选取其相应癌旁正常组织作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测两组组织中miR-574-3p、ZEB1mRNA的表达水平;采用Kaplan-Meier法分析卵巢癌组织中miR-574-3p、ZEB1的表达与患者生存时间的关系;采用多因素Cox回归分析影响卵巢癌患者预后的相关因素。结果与对照组比较,卵巢癌组组织中miR-574-3p表达水平较低(P<0.05),ZEB1表达水平较高(P<0.05);卵巢癌组组织中miR-574-3p与ZEB1mRNA的表达呈负相关(P<0.05);miR-574-3p、ZEB1均与患者淋巴结或腹膜转移、国际妇产科联盟(FIGO)分期相关(P<0.05),ZEB1低表达的卵巢癌患者平均生存时间显著长于ZEB1高表达的卵巢癌患者(P<0.001),miR-574-3p低表达的卵巢癌患者平均生存时间显著短于miR-574-3p高表达的卵巢癌患者(P<0.001);miR-574-3p低表达、ZEB1高表达是影响卵巢癌患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论卵巢癌组织中ZEB1表达上调,miR-574-3p表达下调,且其与患者淋巴结或腹膜转移、FIGO分期相关,可能成为卵巢癌治疗的新靶点。

LncRNA ZEB2-AS1调控miR-574-3p/ZEB1轴对卵巢癌细胞迁移及侵袭的影响

目的探讨长链非编码核糖核酸(LncRNA)锌指E盒结合同源盒蛋白2反义RNA(LncRNA ZEB2-AS)1对卵巢癌细胞迁移、侵袭的影响及可能的作用机制。方法体外培养人卵巢癌细胞(SKOV3、SW626、A2780)和正常人卵巢上皮细胞(HOSEpiC),实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测细胞中ZEB2-AS1、miR-574-3p和锌指E盒结合蛋白(ZEB)1的水平。取对数生长期的SW626细胞,分为对照组、pcDNA3.1-NC组、pcDNA3.1-ZEB2-AS1组、si-NC组、si-ZEB2-AS1组、si-ZEB2-AS1+inhibitor-NC组、si-ZEB2-AS1+miR-574-3p inhibitor组。qRT-PCR检测细胞中ZEB2-AS1、miR-574-3p表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;Western印迹检测细胞ZEB1和迁移、侵袭相关蛋白的表达;双荧光素酶报告基因检测验证ZEB1与miR-574-3p的靶向关系。结果与正常人卵巢上皮细胞HOSEpiC相比,人卵巢癌SKOV3、SW626、A2780细胞中ZEB2-AS1、ZEB1水平明显升高,miR-574-3p水平明显降低(P<0.05),且SW626细胞中ZEB2-AS1表达水平最高。转染后,与对照组相比,pcDNA3.1-ZEB2-AS1组细胞增殖、迁移和侵袭能力及ZEB1、N-钙黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(VIM)、基质金属蛋白酶(MMP)-9表达明显升高,E-cadherin表达明显降低(P<0.05);si-ZEB2-AS1组细胞增殖、迁移和侵袭能力及ZEB1、N-cadherin、VIM、MMP-9表达明显降低,E-cadherin表达明显增加(P<0.05)。与si-ZEB2-AS1组相比,si-ZEB2-AS1+miR-574-3p inhibitor组细胞增殖、迁移和侵袭能力及ZEB1、N-cadherin、VIM、MMP-9表达明显升高,E-cadherin表达明显降低(P<0.05)。双荧光素酶结果显示,高表达miR-574-3p可明显抑制ZEB1 WT的荧光素酶活性(P<0.05)。结论在卵巢癌中,LncRNA ZEB2-AS1过表达可能通过下调miR-574-3p,上调ZEB1的表达,进而诱导上皮-间质转化(EMT),促进卵巢癌细胞的迁移与侵袭。

miR-338-5p通过靶向TSHZ3促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探讨miR-338-5p通过靶向TSHZ3调控膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-338-5p在33例膀胱癌组织和癌旁组织中的表达;在膀胱癌T24和UM-UC-3细胞中分别转染mimics-NC、miR-338-5p mimics、inhibitor-NC和miR-338-5p inhibitor,qRT-PCR检测转染效率;采用CCK-8实验检测过表达或者敲低miR-338-5p对膀胱癌细胞增殖能力的影响;Transwell实验检测miR-338-5p对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响;TargetScan、miRDB和Targetminer数据库预测miR-338-5p潜在的靶基因,选定靶基因TSHZ3;双萤光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-338-5p和TSHZ3的靶向关系;在膀胱癌细胞中共转染miR-338-5p mimics和TSHZ3过表达质粒,通过CCK-8和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力;Western blot检测过表达miR-338-5p或者TSHZ3对Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果miR-338-5p在膀胱癌中表达上调(P<0.05);过表达miR-338-5p提高了膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05),转染miR-338-5p inhibitor则降低了膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05);生物信息学分析和双萤光素酶报告基因实验表明,miR-338-5p和TSHZ3存在靶向关系;挽救实验表明,同时过表达miR-338-5p和TSHZ3部分消除了过表达miR-338-5p对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用(P<0.05);Western blot结果显示,与mimics-NC组比较,过表达miR-338-5p降低了TSHZ3蛋白表达水平,提高了Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平(P<0.05);过表达TSHZ3降低了Wnt3a和β-catenin蛋白表达水平(P<0.05)。结论miR-338-5p在膀胱癌中表达上调,通过靶向抑制TSHZ3的表达促进膀胱癌的增殖、迁移和侵袭,该机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。

过表达miR-23b-3p对甲状腺未分化癌FRO细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨miR-23b-3p对甲状腺未分化癌(ATC)FRO细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 qRT-PCR法检测52例ATC癌组织及其癌旁组织中miR-23b-3p和锌指E盒结合同源框1(ZEB1)的表达水平,并分析两者的相关性。培养人ATC细胞株FRO,将miR-23b-3p mimic及其阴性对照转染至FRO细胞中,qRT-PCR检测miR-23b-3p和ZEB1 mRNA表达水平。体外三维培养观察细胞血管生成拟态(VM)形成能力;Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力;Western blotting检测ZEB1、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白表达水平,双荧光素酶报告实验验证miR-23b-3p和ZEB1的靶向调控关系。结果 ATC组织中miR-23b-3p表达水平低于癌旁组织,而ZEB1的表达水平高于癌旁组织,且两者在ATC组织中的表达水平呈负相关。过表达miR-23b-3p能显著下调ZEB1表达水平,抑制FRO细胞VM形成以及侵袭和迁移能力,同时抑制细胞中VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达。荧光素酶报告实验证实ZEB1是miR-23b-3p的靶基因。结论 过表达miR-23b-3p可能通过靶向下调ZEB1表达抑制FRO细胞的侵袭和迁移能力。

下调lncRNA ZEB1-AS1靶向促进miR-133a-3p表达抑制口腔鳞癌细胞SCC15侵袭和迁移的分子机制

目的 研究下调长链非编码RNA(lncRNA)锌指E-盒结合同源异形盒1-反义链(ZEB1-AS)1靶向促进miR-133a-3p体外调控口腔鳞癌细胞SCC15迁移及侵袭的分子机制。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(Rt-PCR)分析并检测不同的口腔鳞癌细胞HN-6、SCC15、CAL27及正常口腔上皮细胞HOK中ZEB1-AS1表达变化。将口腔鳞癌细胞SCC15分成Control组、sh-NC(转染shRNA control)组、sh-ZEB1-AS1(转染ZEB1-AS1 shRNA)组,利用CCK-8方法分析检测细胞的增殖情况,利用Transwell小室分析并检测细胞的迁移及侵袭能力变化,Western印迹并检测N-钙黏蛋白(cadherin)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、E-cadherin的表达情况。利用Starbase生物信息学软件预测ZEB1-AS1靶基因,荧光素酶报告系统鉴定二者的靶向关系。在口腔鳞癌细胞SCC15中将ZEB1-AS1 shRNA、miR-133a-3p inhibitor转染,同样分析并检测各组细胞的增殖水平及迁移、侵袭能力变化和各组细胞内N-cadherin、MMP-2、E-cadherin、MMP-9蛋白的表达情况。结果 口腔鳞癌细胞CAL27、HN-6、SCC15中ZEB1-AS1水平明显高于正常口腔上皮细胞HOK(P<0.05)。口腔鳞癌细胞CAL27、HN-6中ZEB1-AS1水平明显低于口腔鳞癌细胞SCC15(P<0.05)。与Control、sh-NC组比较,sh-ZEB1-AS1组口腔鳞癌细胞SCC15中ZEB1-AS1水平明显降低,增殖能力明显降低,同时细胞的迁移及侵袭能力也明显下降,蛋白MMP-9、N-cadherin、MMP-2的表达水平明显降低,而E-cadherin表达水平明显升高(P<0.05)。下调ZEB1-AS1靶向促进miR-133a-3p表达。miR-133a-3p inhibitor逆转下调ZEB1-AS1对口腔鳞癌细胞SCC15增殖、迁移、侵袭和MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达作用。结论 下调lncRNA ZEB1-AS1靶向促进miR-133a-3p抑制口腔鳞癌细胞SCC15增殖、侵袭和迁移。

LncRNA HCG11通过调控miR-144-3p/ZEB1分子轴影响直肠癌的发生及转移

目的:探究lncRNA HCG11通过调控miR-144-3p上调锌指蛋白E-盒结合同源异形盒-(1zine finger E box binding homeobox 1, ZEB1)基因的表达促进结直肠癌(colorectal cancer,CRC)发生及转移的分子机制。方法:收集2013年1月至2018年1月云南省肿瘤医院结直肠外科手术切除的78例CRC组织标本及其癌旁组织标本,采用qPCR检测HCG11在CRC癌组织及细胞系中表达情况,以构建的HCG11敲降载体、miR-144-3p模拟物及抑制剂转染CRC细胞株SW480及SW620,CCK-8法及克隆形成实验检测细胞的增殖情况,Transwell实验检测细胞的迁移及侵袭情况。通过Wb及免疫荧光实验检测ZEB1及上皮间质特异蛋白(E-cadherin、Vimentin、ɑ-catenin、Sox2、Nestin、Oct4及Nanog)的表达,通过双荧光素酶报告基因检测HCG11、miR-144-3p及ZEB1的靶向调控关系。建立小鼠移植瘤模型验证敲降HCG11后对小鼠移植瘤生长的抑制作用。结果:HCG11在CRC癌组织的表达显著高于癌旁组织(P<0.01),其在多种CRC细胞系中表达水平明显高于正常肠上皮细胞(均P<0.05);HCG11的表达与CRC患者肿瘤转移、临床分期及预后密切相关(P<0.05或P<0.01)。敲降HCG11后显著抑制CRC细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化及干细胞转化(均P<0.05)。敲降HCG11显著上调miR-144-3p的表达水平(P<0.05),过表达miR-144-3p可显著抑制ZEB1基因的表达(P<0.05)及明显降低双荧光素酶活性(P<0.05)。结论:HCG11通过调控miR-144-3p上调ZEB1的表达,从而促进CRC的发生及转移,HCG11可作为CRC诊断及治疗的靶点。

ZHX3基因沉默对BMSCs中成骨相关因子表达的影响

目的探讨锌指蛋白和同源框3(ZHX3)基因沉默对骨髓间充质干细胞(BMSCs)中smad3、smad4、RUNX2表达的影响。方法构建ZHX3低表达慢病毒载体并转染大鼠BMSCs(ZHX3沉默组),同时设空载病毒转染BMSCs(载体对照组)及不做任何处理的BMSCs(空白对照组)。荧光显微镜下测定细胞转染率并采用免疫印迹技术鉴定转染是否成功;采用免疫荧光化学和免疫印迹技术定性定量检测ZHX3沉默时smad3、smad4、RUNX2表达情况。结果(1)复苏培养的细胞具有BMSCs表型。(2)转染后,ZHX3沉默组和载体对照组均表达绿色荧光,空白对照组不表达荧光,且沉默组ZHX3基因表达显著低于载体对照组。(3)免疫荧光结果显示,smad3、smad4的阳性表达位于细胞核和细胞质,RUNX2的阳性表达主要定位于细胞核。3组细胞均可见阳性表达细胞,且空白对照组与载体对照组之间荧光强度未见显著差异,但ZHX3基因沉默组的荧光强度显著低于2个对照组。(4)免疫印迹检测smad3、smad4、RUNX2的条带于空白对照组和载体对照组中无显著差异,但均显著高于ZHX3沉默组(P<0.05)。结论ZHX3基因沉默后BMSCs体外成骨能力延迟,可能通过下调smad3、smad4、RUNX2来发挥作用。

miR-25-3p和ZEB2在宫颈癌中表达的临床意义及对宫颈癌细胞增殖和侵袭的作用探讨

背景微小RNA-25-3p(microRNA-25-3p,miR-25-3p)是与肿瘤密切相关的miRNA,锌指E盒结合的同源盒蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2,ZEB2)是miR-25-3p的靶基因,而miR-25-3p能否通过靶向ZEB2在宫颈癌进展中发挥作用尚不清楚。目的探讨miR-25-3p、ZEB2在宫颈癌组织中表达的临床意义及对宫颈癌细胞增殖和侵袭的作用。方法选取四川大学华西三亚医院2013年1月-2014年12月治疗的宫颈癌患者84例,获取病理组织,另收集因良性疾病切除的正常宫颈组织40例作为对照,检测宫颈癌组织和正常宫颈组织中miR-25-3p、ZEB2 mRNA及蛋白的表达情况;分析miR-25-3p、ZEB2 mRNA及蛋白的表达与宫颈癌患者临床病理参数及预后的关系。Pearson线性相关分析miR-25-3p与ZEB2 mRNA及蛋白在宫颈癌组织中表达的相关性。常规培养宫颈癌细胞HeLa,分为NC组、miR-25-3p mimic组和miR-25-3p+oe-ZEB2组,MTS实验检测各组细胞的增殖能力,Boyden实验检测各组细胞的侵袭能力。结果miR-25-3p在宫颈癌组织中的表达显著低于其在正常宫颈组织中的表达(P<0.05),ZEB2 mRNA及蛋白在宫颈癌组织中的表达显著高于其在正常宫颈组织中的表达(P<0.05)。miR-25-3p在宫颈癌组织中的表达水平与淋巴结转移、肌层浸润深度和FIGO分期相关(P<0.05)。ZEB2 mRNA及蛋白在宫颈癌组织中的表达水平与组织学分级、淋巴结转移和FIGO分期相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示,miR-25-3p低表达组宫颈癌患者5年总生存率低于miR-25-3p高表达组患者(P<0.05),ZEB2 mRNA及蛋白高表达的宫颈癌患者5年总生存率低于ZEB2低表达组患者(P<0.05)。宫颈癌组织中miR-25-3p与ZEB2 mRNA及蛋白的表达呈负相关(P<0.05)。Target Scan7.1软件预测及双荧光素酶报道基因实验结果显示ZEB2为miR-25-3p的靶基因。与NC组相比,miR-25-3p mimic组和miR-25-3p+oe-ZEB2组细胞增殖和侵袭能力降低(P<0.05);与miR-25-3p mimic组相比,miR-25-3p+oe-ZEB2组细胞增殖和侵袭能力增加(P<0.05)。结论miR-25-3p、ZEB2与宫颈癌患者的不良病理参数和预后相关,miR-25-3p靶向负调控ZEB2抑制宫颈癌的增殖和侵袭。miR-25-3p和ZEB2有可能成为宫颈癌预后新的标志物和治疗靶标。

锌指E盒结合同源盒1通过抑制sirtuin3影响结肠癌细胞能量代谢和转移复发的机制

目的探讨锌指E盒结合同源盒1通过抑制sirtuin3影响结肠癌细胞能量代谢和转移复发的机制。方法使用慢病毒介导的方法沉默锌指E盒结合同源盒1(ZEB1),并使用海马细胞通量分析仪测量ZEB1和甲基CpG结合域蛋白1(MBD1)对有氧糖酵解的影响,反应性氧种类和线粒体膜电位。ZEB1和MBD1之间的相互作用通过免疫共沉淀和免疫荧光测定法进行评估。ZEB1和MBD1相互作用对sirtuin 3(SIRT3)表达的影响通过定量聚合酶链反应、Western印迹、双荧光素酶和染色质免疫沉淀法验证。结果ZEB1是胰腺癌中有氧糖酵解的正向调节剂。ZEB1通过与MBD1的相互作用使SIRT3转录沉默。结论SW620癌细胞中的ZEB1通过与MBD1相互作用沉默SIRT3表达,从而导致线粒体能量代谢功能障碍,最终影响细胞转移复发,可能是细胞对治疗更加敏感的治疗策略。