A study of the relationship between expression level of TRF1 protein and telomerase activity in human acute leukemia

Objective： To study the expression level of TRF1 （telomeric repeat binding factor 1） protein in human acute leukemia and relationship between expression level of TRF1 protein and telomerase, Methods： A quantitative Western±Blot technique was developed using anti±TRF1^33±277 monoclonal antibody and GST±TRFI purity protein as a standard to further determine the expression level of TRF1 protein in total proteins extracted from clinical specimens. Results： Bone marrow tissues of 20 acute leukemia patients were studied, 11 healthy donors＇ bone marrows were taken as a control. The expression level of TRF1 protein was significantly higher （P〈0.01） in normal bone marrow （（2.2174±0.462） μg/μl） than that of acute leukemia patients （（0.7544±0.343） μg/μl）, But there was no remarkable difference between ALL and ANLL patients （（0.6184±0.285） μg/μl vs （0.8454±0.359） μg/μl, P〉0.05）. After chemotherapy, TRFI expression level of patients with complete remission elevated （（0.7724±0.307）/μg/μl vs （1.6834±0,344）μg/μl, P〈0.01 ）, but lower than that of normal （（2.2174±0.462）/μg/μl, P〈0.01）. There was no significantly difference after chemotherapy （（0.7264±0.411） μg/μl vs （0.895±0.339） μg/μl,p〉0.05）. TRF1 expression level of patients with complete remission is higher than that of patients without complete remission （（1,683±0.344）μg/μl vs （0.895±0.339）μg/μl P〈0.01）. All samples were determined for telomerase activity. It was confirmed that the activity of telomerase in normal bone marrow was lower than that of acute leukemia patients （（0.125±0.078） μg/μl vs （0.765±0.284）μg/μl, P〈0.01）. There was no significant difference of expression level ofTRF I protein between ALL and ANLL patients （（0.897±0.290） μg/μl vs （0.677±0.268） μg/μl, P〉0.05）. After chemotherapy, telomerase activity of patients with complete remission decreased （（0.393±0.125） μg/μl）, but was still higher than that of normal （（0.125±0.078） μg/μl, P〈0.01）. Conclusion： The expression level of TRF1 protein has correlativity to the activity of telomerase （P〈0.001）.

莱姆病螺旋体端粒解离酶的表达纯化及其晶体衍射分析

【目的】对莱姆病螺旋体(Borrelia burgdorferi)端粒解离酶(telomere resolvase,ResT)进行原核可溶性表达纯化,并筛选高衍射度的ResT-DNA复合物晶体,为探究ResT-DNA复合物的结构和功能奠定基础。【方法】合成pET28 b-ResT表达质粒,构建原核表达载体pSUMO-ResT,分析ResT可溶性蛋白在BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21 Gold(DE3)pLysS、BL21 Codon Plus(DE3)、Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS中的表达量,获得最优的ResT原核表达菌株。基于AlphaFold预测的ResT蛋白模型,利用定点突变及ResT可溶性蛋白表达分析,获得高效可溶性表达ResT突变体。经Ni-NTA亲和层析、HiTrap Heparin HP亲和层析及分子筛层析对ResT突变体ResT(W94H)进行蛋白纯化。利用EMAS检测ResT(W94H)与DNA的结合能力。使用蛋白晶体接种(seeding)和交叉接种(cross-seeding)方法,利用多种商业化结晶试剂盒筛选并优化ResT-DNA复合物的结晶条件,对复合物晶体进行X射线衍射分析。【结果】BL21 Gold(DE3)pLysS菌株是ResT最佳的高效可溶性表达菌株,W94H突变体比野生型具有更强的可溶性表达。获得了高纯度(95%)且高质量浓度(15 mg/mL)的ResT(W94H),其能够与底物DNA形成稳定的ResT-DNA复合物。在18℃下,ResT-DNA最佳结晶条件是:PEG3350150 g/L、二甲苯二酸钠0.1 mol/L(pH 6.6)、NaCl 0.15 mol/L,ResT-DNA晶体分辨率最高为3.52,晶体空间群为P4。【结论】得到了高纯度ResT(W94H)蛋白,获得了ResT-DNA复合物晶体。

植物端粒DNA结合蛋白及端粒酶活性调控研究

植物衰老和种子劣变机理的研究一直是农业科学领域关注的热点。植物衰老会对农业产生巨大的负面影响,牧草提前衰老也会导致草地生产力下降,限制草产业的发展。由于种子劣变,全球每年约有25%的种子失去活力,导致巨额的经济损失,严重影响农业的健康发展。深入揭示植物衰老特性和调控机制,不仅对于阐明植物生态适应性及种群稳定性具有重要价值,而且对于延缓衰老技术和调控措施的选择具有重要实践意义。在模式植物拟南芥研究中发现,染色体端粒与植物衰老以及种子活力密切相关。端粒是染色体末端的重复DNA序列,由端粒DNA和结合蛋白组成。端粒结合蛋白是一组与端粒DNA结合的蛋白质,主要是帮助稳定端粒结构并保护端粒免受DNA修复系统的干扰,其次还参与了基因表达、DNA复制和染色体结构调节等许多生物学过程。端粒酶由端粒酶逆转录酶(TERT)和端粒酶RNA(TER)两个亚单位组成,端粒酶逆转录酶亚基参与线粒体功能以及相关基因表达调控,通过对端粒酶新功能的探索,有助于提高植物的抗逆性,从而延缓植物的衰老进程,为提高作物产量提供一条新的途径。近年来在植物中研究发现,端粒的动态变化与植物衰老存在相关性,植物端粒内稳态的维持机制仍存在许多问题,端粒长度以及端粒酶活性的动态变化与植物衰老以及种子老化的关系尚不清楚。基于此,本研究综述了端粒和端粒结合蛋白在植物生物学中的作用,重点论述了端粒和端粒结合蛋白调控端粒长度以及端粒酶活性的模式,为后续解析植物衰老以及种子劣变机理提供理论参考依据。

链霉菌中一类同源非典型端粒的克隆及分析

采用自连接-PCR的方法克隆和测序了Streptomyces cattleya DSM46488、Streptomyces mobaraensisDSM40847及Streptomyces davawensisJCM4913的端粒,序列比对发现,这3种端粒具有较高的序列相似性,前60个核苷酸的序列相似性达到了80%以上;在二级结构水平,这些端粒含有多个回文序列,其中,包含相同的回文序列I和II,但并不能通过折返形成超级发夹结构;Streptomyces cattleya DSM46488、StreptomycesmobaraensisDSM40847及Streptomyces davawensis JCM4913的端粒与线性质粒pSHJG1端粒及Streptomyces albus J1074染色体端粒均具有较高的序列相似性;系统发育分析显示它们与典型端粒及其他非典型端粒处于不同的进化分支,S.cattleyaDSM46488、S.mobaraensis DSM40847、S.davawensisJCM4913、S.albus J1074及S.hydroscopicussubsp.Jinggangensis 5008都编码同源的潜在末端蛋白-端粒相关蛋白,暗示了这类同源的非典型端粒系统广泛存在于链霉菌中。

颅内动脉瘤模型大鼠端粒长度与端粒结合蛋白基因表达变化

目的探讨颅内动脉瘤(IA)大鼠外周血端粒长度及其结合蛋白基因表达变化,初步探讨IA的潜在机制。方法将24只SD雌性大鼠随机等分为两组,即对照组和IA模型组(以下简称模型组)。模型组结扎左侧颈总动脉、结扎双侧肾动脉后支、切除双侧卵巢,并于造模后1周喂同时含8%氯化钠和3%L-甲硫氨酸的饲料。对照组则仅暴露左侧颈总动脉和双肾20 min后缝合皮肤,喂常规饲料。两组大鼠分别于造模前和造模后6个月时进行眶下静脉丛取血并提取外周血基因组DNA,检测相对端粒长度。造模后6个月时处死前测量血压及检测血清中雌二醇、同型半胱氨酸(Hcy)水平,提取外周血总RNA并检测6种端粒结合蛋白[端粒重复序列结合因子1(TRF1)、端粒重复序列结合因子2(TRF2)、端粒保护蛋白1(POT1)、肾上腺皮质增生蛋白同源异构体(TPP1)、TRF1相互作用核蛋白2(TIN2)、阻滞活化蛋白1(RAP1)]基因表达水平的变化。处死后通过血管铸型观察IA形成情况。结果造模后6个月时,模型组大鼠收缩压和血清Hcy水平均高于对照组(P<0.05),雌二醇水平低于对照组(P<0.05)。模型组与对照组大鼠初始(0个月时)外周血端粒长度比较,差异无统计学意义(P>0.05);造模后6个月时,模型组大鼠端粒长度明显短于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后6个月时,模型组大鼠外周血的TRF2和TPP1基因表达水平明显高于对照组(P<0.05),而TRF1、POT1、TIN2和RAP1基因表达水平与对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论IA模型大鼠造模后6个月时,外周血端粒长度明显缩短,端粒结合蛋白TRF2和TPP1基因表达水平上调,这可能与IA的病因机制相关。

tRF-1:30对高糖诱导的肾小管上皮细胞炎性因子表达的影响

目的探讨tRF-1:30(tRF-1:30-Gln-CTG-4)对高糖(HG)诱导的肾小管上皮细胞(RTECs)中炎性因子表达的影响及分子机制。方法将小鼠RTECs分为Control组、HG组、HG+tRF-1:30 mimic组、HG+tRF-1:30 NC组、HG+si-IKZF2组(IKAROS家族锌指2,tRF-1:30抑制剂)、HG+si-NC组。实时荧光定量PCR检测tRF-1:30、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和IKZF2 mRNA的水平。酶联免疫吸附试验检测炎性因子水平,Western blot检测IKZF2蛋白表达水平,双萤光素酶报告实验验证tRF-1:30和IKZF2的关系。结果在HG诱导的RTECs中炎性因子的表达水平显著升高,而tRF-1:30表达水平显著降低。过表达tRF-1:30显著降低HG诱导的RTECs中炎性因子的表达水平。IKZF2在HG诱导的RTECs中显著高表达,进一步敲低IKZF2可抑制炎性因子的释放,而过表达tRF-1:30后IKZF2的表达水平下调。双萤光素酶报告实验进一步验证tRF-1:30与IKZF2可能存在靶向关系。结论过表达tRF-1:30可能通过负向调控IKZF2的表达进而抑制HG诱导的RTECs炎性因子的释放。

一个可能的与人端粒结合因子相互作用蛋白Tara的分离和克隆

目的 :分离和鉴定端粒结合因子 (TRF1)免疫共沉淀蛋白复合物并克隆其基因。方法 :以 TRF1抗体应用免疫共沉淀方法 ,从细胞蛋白抽提物中分离 TRF1蛋白复合物 ,并作蛋白质肽指纹谱鉴定 ;应用温度梯度 PCR,从人 c DNA文库中扩增目的基因 ,并构建 p EGFP- C2真核表达载体 ;核苷酸测序和 Western blot验证目的基因序列和表达载体。结果 :从 TRF1免疫沉淀复合物中分离出了 Tara蛋白 ;人 c DNA文库中 PCR扩增所得产物为 1.7kb,与 Tara基因 CDS序列同源性为 99.9% ;GFP/ Tara融合蛋白约 10 0 k D,Tara在间期 He La细胞中弥散表达于胞浆 ,而有丝分裂细胞则定位于整个细胞。结论 :Tara是一个可能的 TRF1相互作用蛋白 ,其作用机制需进一步实验研究。

人成釉细胞瘤中蛋白激酶C-α表达与端粒酶活性的关系

目的:研究蛋白激酶C-α(PKCα)在人成釉细胞瘤(AB)中的表达及与端粒酶逆转录酶(hTERT)的关系,探讨其临床生物学意义。方法:用原位杂交和免疫组化SP法分别检测了AB中hTERT mRNA及PKCα蛋白的表达。同时选取牙源性角化囊肿(OKC)16例,正常口腔黏膜7例做对比研究。结果:hTERT mRNA在AB中阳性率为94.4%(51/54),OKC中为87.5%(14/16)及1/7正常口腔黏膜有hTERT mRNA表达,组间差异有显著性(P<0.001)。伴随AB的复发与恶变hTERT的表达逐渐增高。PKCα在AB中阳性表达为85.1%(46/54),OKC中为56.2%(9/16),4/7正常口腔黏膜有PKCα阳性,组间差异有显著性(P<0.01),伴随AB的复发与恶变PKCα阳性表达也随之增高(P<0.05)。hTERT阳性表达与PKCα阳性表达之间经Kendall相关分析rk=1.000,P=0.005呈高度正相关。结论:hTERT与AB的发生发展及临床生物学行为相关,端粒酶活性的释放激活与PKCα的高表达可能正相关。

辛伐他汀对颅内动脉瘤大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶及端粒重复序列结合因子2基因表达的影响

目的探讨辛伐他汀对颅内动脉瘤(IA)大鼠端粒长度、端粒酶反转录酶(TERT)和端粒重复序列结合因子2(TRF2)基因表达的影响。方法将36只SD大鼠分为对照组、模型组和辛伐他汀组,每组12只。对模型组及辛伐他丁组的大鼠切除双侧卵巢并结扎左侧颈总动脉及双侧肾动脉后支以构建IA模型,对照组仅暴露相应组织及血管后缝合。建模后模型组和辛伐他汀组分别给予生理盐水及辛伐他汀灌胃。于建模后4个月,测定各组大鼠外周血白细胞端粒相对长度、TERT和TRF2 mRNA的相对表达量。结果建模后4个月,模型组和辛伐他汀组各有8只大鼠形成IA,对照组无大鼠形成IA;对照组、辛伐他汀组和模型组大鼠的端粒相对长度依次缩短(P<0.05),而对照组、模型组和辛伐他汀组TRF2 mRNA相对表达量依次升高(P<0.05);模型组和辛伐他汀组的TERT mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05),但两组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 IA大鼠可能由于端粒酶活性降低而发生端粒长度缩短,辛伐他汀可通过促进TRF2的表达而发挥保护端粒作用。

急性白血病患者端粒长度、端粒酶活性、端粒酶逆转录酶及TRF1的表达和相互关系的研究

目的探讨急性白血病患者端粒长度、端粒酶活性、端粒酶逆转录酶(human telomcrase reverse transcriptase,hTERT) 及端粒重复序列结合因子1(human telomeric-repeat binding factor,TRF1)的表达及它们之间的关系。方法采用端粒酶PCR-ELISA半定量法对30例初治急性白血病患者及11例对照的骨髓单个核细胞的端粒酶活性进行了检测,采用RT-PCR 法对其进行hTERT及TRF1基因mRNA的表达检测,并同时采用Sourhern bloting法对患者及对照进行了端粒长度的检测。结果急性白血病患者端粒酶活性、hTERT表达水平分别为0.69±0.33、0.47±0.37,明显高于对照组(P<0.01)。急性白血病患者的平均TRF1表达水平为0.45±0.25,明显低于对照组(P<0.05)。急性白血病患者的平均端粒长度为(6.1±1.9)kb·对照组(9.5±1.4)kb,两组区别具有显著意义(P<0.01)。端粒酶活性与hTERT的表达呈正相关(P<0.01)。端粒较短的患者的平均端粒酶活性0.77±0.29,而端粒较长的患者的平均端粒酶活性为0.46±0.34、两组区别具有显著意义(P <0.05)。hTERT及TRF1的表达水平在这两组分别为0.54±0.38、0.50±0.24和0.28±0.28、0.32±0.23,相对于端粒较长的患者。端粒较短的患者的hTERT及TRF1表达水平有升高趋势(P=0.06、P=0.08)。结论急性初治白血病患者端粒酶活性、hTERT的表达升高,hTERT的表达的上调可能是激活端粒酶的重要调节因素。急性白血病细胞端粒酶活化可能与其端粒缩短有关。端粒酶依赖的端粒机制的激活,在白血病的发生中可能起着重要作用。TRF1的表达适当下调可能对白血病细胞端粒长度的维持起重要作用。端粒较短的急性白血病患者在激活了端粒酶的活性之后,可能需要相对较多的TRF1等端粒长度的负调控因素来维持端粒长度的稳定。

人端粒重复序列结合因子1^(33-277)在大肠杆菌中的克隆及高效表达

目的 :建立能高效表达人端粒重复序列结合因子 1第 33- 2 77位 (TRF1 33- 2 77)氨基酸的菌株并制备多抗。方法 :设计一对引物 ,分别带有 Kpn 和 Eco RI位点 ,从已经克隆了 TRF1 c DNA全长的重组质粒 p CR -TOPO-TRF1扩增 TRF1 33- 2 77c DNA片段 ,克隆入 PGEM-T质粒 ,测序和酶切图谱鉴定 ,Eco RI酶切后亚克隆入 p GEX-3X的 Eco RI位点之间 ,筛选正向插入重组子。转化大肠杆菌 DH5 a,筛选高表达菌株。结果 :得到高效表达融合蛋白的菌株 DH5 a-TRF1 33- 2 77。其融合蛋白经western blot证实具 TRF1抗原性。结论 :所建立的菌株为 h TRF1单克隆和多克隆抗体制备提供蛋白来源。

hTERT和β-catenin在胆囊癌中的表达及其临床意义

目的检测hTERT和-βcatenin在胆囊癌中的表达情况,分析其与临床病理特征及病人生存期之间的关系。方法收集正常及炎性胆囊、胆囊癌非相关息肉、胆囊癌相关息肉和胆囊癌各20、19、16、82例。用免疫组化方法分别检测hTERT、-βcatenin蛋白表达。结果①hTERT在正常及炎性胆囊、胆囊癌非相关息肉、胆囊癌相关息肉和胆囊癌中阳性率分别为0、5.3%、37.5%、84.1%,后两组hTERT表达率显著高于前两组(P<0.05),胆囊癌组hTERT表达率亦显著高于第3组(P<0.001)。-βcatenin在正常及炎性胆囊、胆囊癌非相关息肉、胆囊癌相关息肉和胆囊癌中异位表达率分别为5.0%、10.5%、50.0%、51.2%。后两组-βcatenin表达率显著高于前两组(P<0.05)。②hTERT在T1+T2、T3+T4和淋巴结阳性、阴性组中的表达率分别为72.7%、92.8%(P<0.05)和93.6%、71.4%(P<0.05),差异有显著性。hTERT表达水平与胆囊癌分化程度、浸润深度、淋巴结有无转移的相关系数分别为0.5、0.4、-0.5(P<0.01)。-βcatenin在T1+T2、T3+T4和淋巴结阳性、阴性组中异位表达率分别为33.3%、63.3%(P<0.01)和57.4%、42.9%(P<0.05),差异有显著性。③胆囊癌hTERT阴性、阳性表达累积生存率分别为22.8%、5.9%(P<0.05)。胆囊癌异位-βcatenin阴性、阳性表达累积生存率分别为17.1%、5.7%(P<0.05)。④胆囊癌hTERT蛋白与-βcatenin异位蛋白表达呈正相关(r=0.311,P<0.05)。结论hTERT和-βcatenin蛋白异位表达与胆囊的恶性病变密切相关。hTERT表达与胆囊癌相关息肉及其恶性转化有关。hTERT和-βcatenin蛋白与肿瘤不良预后有关。-βcatenin异位表达增加与胆囊癌hTERT表达增强相关联。

P53与端粒重复序列结合蛋白质1的体外相互作用

目的 :通过分析端粒主要结合蛋白中端粒重复序列结合蛋白质 1(Telomericrepeatbindingprotein 1,TRBP1)与P5 3的体外结合 ,探讨P5 3通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制。方法 :谷胱甘肽S转移酶 (glu tathioneS transferase ,GST)和人P5 3 GST融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽 SepharoseTM4B纯化后 ,和人乳腺癌细胞MCF 7细胞蛋白进行体外结合反应 (pulldown) ,Westernblot检测反应物中P5 3和TRBP1的结合。融合蛋白中人P5 3包括野生型 (1～ 393)、C端缺失体P5 3N5 (2～ 2 93)、N端缺失体P5 32C(95～ 393)、175单个氨基酸突变体P5 3R175H(R→H)。结果 :聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝R2 5 0染色显示 ,纯化的GST和 4种P5 3 GST蛋白纯度在 90 %以上 ,且分子量与预计的完全一致。TRBP1的Westernblot显示 ,野生型P5 3和P5 3 R175H均能沉淀MCF 7中的TRBP1,且结合力相似 ,而单独的GST则无沉淀TRBP1的作用。与野生型P5 3和P5 3R175H相比 ,P5 32C与TRBP1的结合力明显增加 ,P5 3N5与TRBP1的结合力明显减弱。结论 :P5 3和TRBP1可以直接体外结合 ,P5 3的C端 (2 93～ 393)是与TRBP1结合的结构域。P5 3和TRBP1结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关。

雄激素缺乏及外源性睾酮对雄性小鼠心脏衰老的影响

目的探讨雄激素缺乏是否与心脏衰老有关,以及不同剂量丙酸睾酮对心脏衰老的影响。方法雄性C57BL,/6J小鼠32只随机分为正常组(8只)、去势+安慰剂组(去势组,8只)、去势+生理剂量睾酮组(生理剂量组,8只)、去势+大剂量睾酮组(大剂量组,8只)。治疗3个月后测定各组血清睾酮浓度,分离心肌组织荧光实时定量PCR测定端粒长度以及Western b10t测定去磷酸化Rb蛋白表达量。结果与正常组比较,去势组小鼠睾酮明显降低(P<0.01),端粒长度明显缩短(P=0.029),去磷酸化Rb蛋白表达明显增加(P<0.01)。治疗3个月后,与去势组比较,生理剂量组小鼠端粒长度明显延长(P<0.01);去磷酸化Rb蛋白表达明显减少(P<0.05);大剂量组小鼠端粒长度进一步缩短(P<0.05);去磷酸化Rb蛋白表达进一步增加(P<0.01)。结论雄激素缺乏小鼠心肌组织发生衰老,给予生理剂量睾酮可延缓心脏衰老,大剂量睾酮对心脏衰老有促进作用。

端粒酶的研究进展

端粒酶是由RNA模板和蛋白质催化亚基组成的核糖蛋白颗粒。它解决染色体的未端复制问题 ,归属于逆转录酶家族又和逆转录酶有一定的差别。端粒酶的缺失能在细胞和机体水平引起各种疾病的发生 ,且端粒的过度表达和细胞的永生化和癌变直接相关 ,其中端粒蛋白在此过程中可能起调控作用。端粒酶的结构和功能决定了它有广泛的应用前景。

端粒重复序列结合因子在肾脏肿瘤中的表达水平

目的 :研究 TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤及相应癌旁组织中的表达水平。方法 :定量分析肾组织中 TRF1蛋白的表达水平 ,应用经倍比稀释的 TRF13 3 -2 77纯化蛋白作为定量标准 ,建立了以抗 TRF13 3 -2 77单抗作定量 Wes-tern- blot的方法 ,并以该方法检测 TRF1蛋白在组织中的表达水平。结果 :32例肾肿瘤样本均不同程度的表达TRF1蛋白质 ,均值为 2 .4 2 8± 1.35 2 μg/ μl,癌旁自身对照组织 TRF1的表达水平为 3.6 11± 1.92 2 μg/ μl(t=5 .776 ,P<0 .0 0 1)。肿瘤组织内 TRF13 3 -2 77表达水平较相应癌旁组织显著降低 ,并与肿瘤的恶性程度相关 ,差异具有显著性意义 (P<0 .0 1)。结论 :TRF1蛋白在肾脏恶性肿瘤中的表达明显减低 ,并与肿瘤恶性程度呈负相关。

急性白血病细胞端粒结合蛋白2表达的研究

目的:研究人类白血病细胞株及原代白血病细胞中人端粒结合蛋白2(TRF2)的表达。方法:应用实时定量RT-PCR,检测白血病细胞株及原代白血病细胞中TRF2 mRNA的表达,应用Western Blot,检测TRF2蛋白的表达。结果:T淋巴系白血病细胞株的TRF2表达显著高于骨髓单个核细胞和髓系白血病细胞株。在原代白血病细胞中,M0和M1亚型患者白血病细胞TRF2的表达高于其他各亚型急性髓系白血病(AML)患者。结论:预后差的AML患者和T细胞恶性肿瘤细胞株高表达TRF2,提示TRF2高表达可能和白血病的预后有关。

人胚肺成纤维细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的表达

背景:端粒相关蛋白直接影响端粒的功能,调节端粒DNA的长度,与细胞的衰老和癌变密切相关。目的:通过观察正常细胞复制性衰老过程中端粒相关因子的变化来找寻细胞正常衰老过程中的关键调控分子。方法:在构建好的细胞复制性衰老模型基础上,利用RT-PCR与westernblot方法在分子与蛋白水平检测端粒相关因子的表达变化,主要检测人胚肺成纤维细胞在复制性衰老过程中端粒相关因子人端粒结合蛋白1、端锚聚合酶1、端粒酶RNA、端粒末端保护蛋白1以及P53的表达情况。结果与结论:结果显示,随着细胞的衰老,人端粒结合蛋白1的转录水平未发生改变,而人端粒结合蛋白1的蛋白表达水平有逐渐升高而后快速降低的过程;端锚聚合酶1的mRNA水平及蛋白表达水平未发生变化;端粒末端保护蛋白1随着人胚肺成纤维细胞的衰老表达水平逐渐降低;端粒酶RNA组分随着细胞的衰老呈递增趋势;P53的蛋白表达未发生变化。综上认为,人端粒结合蛋白1、端粒末端保护蛋白1及端粒酶RNA在细胞的复制性衰老过程中起重要作用。

一组端粒相关蛋白分子的克隆

目的:进一步了解端粒酶的生物学功能及其在永生化或肿瘤细胞中作用的分子机制,筛选新的端粒相关蛋白分子.方法:基于酵母双杂交技术原理,采用DNA重组技术构建诱饵融合蛋白表达载体,筛选cDNA文库,β-半乳糖苷酶滤膜影印分析确证阳性克隆,对阳性克隆质粒测序并在GenBank进行cDNA序列同源性比较.结果:AH109、Y187酵母菌基因表型稳定,无His渗漏表达.成功构建端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT,其表达的融合蛋白对AH109酵母细胞生长无毒性且不具有激活自身报告基因(LacZ)的作用.从cDNA文库中筛选到Ade+、Leu+、Trp+和His+阳性克隆28个,β-半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析筛选到Ade+、His+和LacZ+阳性克隆12个,其中有5个文库质粒具有自身激活报告基因的作用,予以弃除.7个阳性克隆质粒测序发现有2个为重复序列,cDNA序列同源性比较最终获得6个已收录人cDNA序列,他们分别为T-STAR、PAWR、I-1、SMARCB1、LOXL3和HKR3.结论:获取新的端粒相关蛋白可了解端粒酶全酶的结构及其在肿瘤、细胞永生化的生物学功能及分子机制,为肿瘤、衰老的发生及防治奠定重要的理论基础.

胃癌及癌前组织中端粒酶活性及端粒限制性片段长度的检测及其临床意义

采用ＴＲＡＰ法检测了１７６例不同病变胃粘膜组织端粒酶活性（ＴＡ），同时采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交技术检测了３５例胃癌及其相应的１９例癌旁和１３例手术切缘组织端粒限制性片段（ＴＲＦ）长度。结果显示：①１７６例不同胃粘膜病变中，慢性萎缩性胃炎（ＣＡＧ）、肠上皮化生（ＩＭ）、异型增生（Ｄｙｓ）及胃癌（ＧＣ）ＴＡ阳性检出率分别为２４．６％、３８．５％、３７．５％及９２．３％，而正常组织（Ｎ）未检出ＴＡ，明显低于以上各组（Ｐ＜０．０１～０．０５），癌组织ＴＡ阳性率亦明显高于ＣＡＧ、ＩＭ及Ｄｙｓ组（Ｐ＜０．０１），ＴＡ阳性检出率与患者临床病理指标无明显相关性；②ＴＲＦ长度随Ｎ→ＣＡＧ→ＩＭ→Ｄｙｓ→ＧＣ有逐渐缩短的趋势，但仅Ｎ及ＣＡＧ组较ＧＣ组明显延长（Ｐ＜０．０１），与癌旁和（或）手术切缘组织比较，肿瘤组织ＴＲＦ缩短者占２０（５７．１％），无变化和延长者占１５（４２．９％），二者比较差异无显著性意义（Ｐ＞０．０５），ＴＲＦ长度与性别、肿瘤大小、分化程度、临床分期及ＴＡ无明显相关性，但与年龄有一定的关系。ＴＡ不仅在胃癌组织中可以检测到，而且在胃粘膜癌前病变或疾病中亦有表达，提示ＴＡ的检测在胃粘膜癌变的早期诊断和预测方面具?