应用Tem-PCR技术同时检测3种致病菌的研究

应用靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)技术建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157三种致病菌的高通量简易检测方法.实验分别以沙门氏菌的inv A基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、大肠埃希氏菌O157 rfb E基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了TemPCR检测方法.结果表明,建立的Tem-PCR方法特异性强,其检测灵敏度分别为沙门氏菌1.1×103CFU/m L、单核细胞增生李斯特氏菌5.6×102CFU/m L、大肠埃希氏菌O157 2.3×103CFU/m L.方法不需要优化调整各引物对的浓度,易于使用,有效地解决了传统多重PCR方法扩增效率不均衡的问题.

3种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立

应用靶序列富集多重聚合酶链式反应（t arget-enriched multiplex-polymerase chain reaction,Tem-PCR）技术建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌3种食源性致病菌的快速检测方法。分别以金黄色葡萄球菌fem A基因、沙门氏菌inv A基因和志贺氏菌ipa H基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了Tem-PCR检测方法。结果显示,建立的Tem-PCR方法特异性强,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别为1.1×10^3、2×10^3 CFU/m L和1.2×10^3 CFU/m L。Tem-PCR检测方法有效地解决了传统多重PCR引物扩增效率不均衡的问题。

麻旺鸭源大肠杆菌耐药表型分析及β-内酰胺酶、PMQR基因检测

本研究旨在了解麻旺鸭源大肠杆菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、酰氨醇类、氟喹诺酮类和磺胺类药物的耐药情况以及β-内酰胺酶基因和质粒介导的喹诺酮耐药(plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR)基因流行情况。从重庆市酉阳县4个麻旺鸭养殖场采集146份泄殖腔拭子样品,经选择性增菌和PCR扩增大肠杆菌特异性phoA基因分离鉴定大肠杆菌。采用纸片扩散法测定分离菌对25种抗菌药物的耐药性并检测分离菌株中的β-内酰胺酶基因和PMQR基因。结果显示:共分离到大肠杆菌146株。这些菌株对氨苄西林、头孢唑啉耐药严重,耐药率超过50%;对庆大霉素、阿米卡星、氧氟沙星完全敏感。分别有111株(76.0%)和83株(56.8%)菌携带至少1种β-内酰胺酶基因和PMQR基因,其中bla_(TEM)(74.0%,108/146)和qnrS(54.8%,80/146)基因最为流行。63株菌同时携带β-内酰胺酶基因和PMQR基因。麻旺鸭源大肠杆菌对常用抗菌药物存在耐药,且广泛携带β-内酰胺酶基因和PMQR基因。

分子鉴别诊断(MDD)技术在呼吸道病原体检测中的应用

目的:以靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)和液相芯片(xMAP)检测技术结合,建立常见呼吸道病原体的分子鉴别诊断(MDD)平台,对其可靠性进行评估,并用于临床样品的检测。方法:采集苏州大学附属儿童医院呼吸科住院病例呼吸道灌洗液样品22例和苏州大学附属第一医院呼吸内科门诊病例咽拭子样品20例,使用Tem-PCR技术对样品的核酸进行多重扩增,以液相芯片技术进行高通量的多重检测。结果:对已知样品的检测表明该平台具有高度的特异性和敏感性。对42例临床样品进行检测的结果显示,22例呼吸道灌洗液的阳性检出率为63.6%。呼吸道灌洗液阳性检出率高于门诊病例咽拭子样品的阳性检出率,RNA病原体(以病毒为主)的阳性率高于DNA病原体(以细菌为主)的阳性率。结论:建立了呼吸道病原体的MDD平台,具备了对呼吸道传染性疾病的高通量快速诊断能力。

靶序列富集多重PCR技术的发展及其应用

靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem–PCR)作为一种新型的分子生物学高通量检测技术,通过靶序列富集、靶序列加标签以及超级引物扩增3个阶段实现对靶标序列的大量扩增。靶序列富集多重PCR具有独特的反应过程,克服了常规多重PCR扩增条件不兼容、扩增具有偏爱性等缺点,实现了对同一反应体系多种病原的同步检测,为临床病原鉴别诊断、基因分型、耐药基因等领域的研究提供了新思路,具有较大的发展前景。笔者对Tem–PCR的研究背景、反应原理、技术应用及试剂盒开发等进行综述,旨在为Tem–PCR的研究和发展提供参考依据,为中国应对公共卫生危机提供新思路。

革兰阴性杆菌TEM型β-内酰胺酶耐药基因研究

目的了解中南大学3所附属医院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)革兰阴性杆菌TEM型耐药基因的检出及流行情况。方法收集254株多重耐药革兰阴性杆菌,采用双纸片协同法(DDS)进行ESBLs表型确证,多重PCR法扩增blaTEM、blaSHV、blaOXA-1基因,TEM特异性引物对其整个开放阅读框进行扩增并对PCR产物测序,通过BLAST分析确定基因型;并对携带有TEM基因的革兰阴性菌株用随机扩增多态DNA(RAPD)方法进行菌株的同源性分析。结果经多重PCR扩增,105株肠杆菌获得阳性结果,其中85株菌携带TEM基因,26株菌携带SHV基因,10株菌携带OXA-1基因;6株非发酵菌获得阳性结果,均携带TEM基因,且全部为TEM-1型广谱β-内酰胺酶。携带blaTEM耐药基因的菌株所含RAPD类型:大肠埃希菌12种,肺炎克雷伯菌6种,阴沟肠杆菌7种。结论 TEM-1型β-内酰胺酶是湖南地区主要流行的TEM型酶;大肠埃希菌产TEM酶情况尤为突出;在同一医院以及同一病区存在TEM-1型β-内酰胺酶的克隆传播。

日本柑橘黄龙病病原体电镜观察及PCR检测

对日本柑橘黄龙病病原体的形态结构进行了电镜观察,结果发现柑橘黄龙病病菌日本株系绝大多数是球形和短椭圆形,极少观察到棒状形态,直径为100～500 nm,外被一层胶状物质包围,厚约10～50 nm,这与其他地区发现的柑橘黄龙病病原体形态不同.PCR检测表明,以硅藻土法提取的DNA为模板,利用Ready-To-GoTM PCR bead法可以得到理想结果.

4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法的建立

目的建立一种基于液相芯片系统的4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法,为有效防控其发生和流行提供有力手段。方法针对A型流感病毒(influenza A virus,FluA)、B型流感病毒(influenza B virus,FluB)、呼吸道合胞病毒A型(respiratory syncytial viruse types A,RSVA)和B型(respiratory syncytial viruse types B,RSVB)的保守区序列分别设计并合成了特异性引物、探针和通用引物,构建4种病原体阳性参比品,通过对扩增和杂交条件的优化,建立了靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)和Luminex液相芯片(xMAP)技术相结合的检测系统,并对该检测系统进行了方法学评价。结果该检测方法可以特异性区分4种病毒的RNA靶标分子,检测下限均为10拷贝/μl。结论该种基于液相芯片系统的新方法灵敏度高、特异性好,为实现在临床呼吸道样品中同时快速检测4种常见呼吸道病毒提供了技术基础。

大黄素对鼻咽癌CNE-1细胞放射增敏作用与细胞自噬关系的研究

目的研究大黄素在放射增敏过程中对鼻咽癌CNE-1细胞是否产生自噬现象,并探讨其放射增敏作用与自噬相关基因mRNA表达的关系。方法鼻咽癌细胞分为空白组、大黄素组、照射组和大黄素联合射线增敏组,采用透射电镜观察各组细胞内自噬小体的形成及超微结构的改变,并运用荧光定量PCR方法检测基因ULK1、GABARAPL1、Beclin1、Bcl-2的mRNA表达水平。结果除空白组外其余各实验组均可观察到自噬小体的形成。与空白组比较,各组ULK1mRNA表达均升高(P<0.05),其中大黄素增敏组表达最高(P<0.01);而Beclin1和Bcl-2 mRNA表达下调;GABARA-PL1除大黄素增敏组升高外(P<0.05),其它各组变化不明显。结论大黄素在鼻咽癌细胞放射增敏过程伴随着自噬产生,自噬性死亡可能是大黄素放射增敏的途径之一。

屠宰猪肝脏中乙型肝炎病毒的PCR检测与电镜观察

为探讨屠宰猪体内乙型肝炎病毒(HBV)流行情况,从北京某屠宰场采集肝脏样品,应用1对乙型肝炎病毒(HBV)S基因保守区的引物,采用PCR方法从屠宰猪肝脏中检测到HBV,序列分析表明,扩增片段与人HBV S基因的同源性高达99.05%;利用透射电镜观察到了样品中的病毒样离子。

套式聚合酶链反应直接测序法分析产超广谱β-内酰胺酶菌TEM全基因

目的 建立套式聚合酶链反应直接测序方法分析产超广谱 β 内酰胺酶菌TEM全基因 ,以便TEM分型和发现新的亚型。方法 根据Genbank核酸数据库已登录的TEM各亚型序列 ,在保守区自行设计 4条引物 ,分A、B两段半套式重叠扩增TEM全基因 ;并对A段作正向测序 ,B段作反向测序。结果 大肠埃希菌TEM 1、TEM 2、TEM2 6等 3种典型菌株均成功扩出A、B两段 ,产物直接测序波峰锐利 ,信噪比值高。该三株菌测得的序列与已在Genbank登录的序列一致。

多重降落PCR检测血流感染产ESBLs肠杆菌科细菌与MRSA方法的建立和应用

目的探索一种可同时检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肠杆菌科细菌与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的多重降落PCR方法。方法收集某院20l3年3月—2014年9月102份住院患者血培养阳性标本,针对产ESBLs肠杆菌科细菌的SHV、TEM、OXA基因和MRSA的MecA基因设计4对特异性引物,分别采用单一降落PCR和多重降落PCR对各耐药基因进行扩增,并将结果与药敏纸片法进行比较。结果各单一PCR均可扩增出特异性条带,并用多重降落PCR同时检测了4种耐药基因;建立的多重降落PCR对4种耐药基因(MecA、SHV、TEM、OXA)DNA的检测下限分别为4.37、2.19、4.53和3.59 ng。与药敏纸片法相比,多重降落PCR总灵敏度与特异性分别为100.00%、88.24%,检测ESBLs的灵敏度达100.00%,特异性为87.23%,检测MRSA的灵敏度和特异度均为100.00%。结论该实验建立的多重降落PCR具有高灵敏度与特异性,可用于产ESBLs肠杆菌科细菌和MRSA所致血流感染的快速诊断与流行病学调查,有利于指导临床使用抗菌药物。

草莓镶脉病毒粒子提取及电镜观察

从受感染的草莓（Fragaria sp）植株中提取了草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）粒子并对其进行了电镜观察.用CTAB法从草莓叶片中提取总核酸,设计SVBV外壳蛋白基因特异性引物,利用PCR方法对杭州地区的草莓镶脉病毒感染情况进行检测.检测结果表明,在杭州地区大田种植的草莓中存在SVBV感染现象.从4株受感染草莓植株中分离克隆了SVBV的CP基因片段并测序;序列比较分析发现它们与已报道的美国SVBV分离物的CP基因（序列号NC_001725）核苷酸同源性为91％.利用差速离心法从上述草莓植株的叶片中提纯SVBV病毒,在透射电镜下观察到SVBV病毒粒子呈球形,直径约为40-55 nm.

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛体外表达条件研究

为筛选肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)SEF14菌毛体外表达的最适培养条件,本研究对4种不同培养条件下S.enteritidis SEF14菌毛的体外表达情况进行了比较研究,并通过RT-PCR、透射电镜与免疫电镜观察和SDS-PAGE等方法进行验证。研究表明,其中以TSB肉汤25℃震荡培养24 h后转接20℃继续震荡培养24 h,最后转接粘附因子抗原培养基(CFA)(pH6.0)于37℃静置培养50 h^60 h的SEF14菌毛表达量最高。RT-PCR结果显示在该培养条件下SEF14菌毛主要亚单位蛋白编码基因sefA mRNA表达水平最高,在透射电镜和免疫电镜下均可观察到丰富的SEF14菌毛。SDS-PAGE结果显示,所抽提的菌毛蛋白大小为14.3 ku,与相关报道一致,而且等量菌泥的抽提量最大。

实时荧光聚合酶链反应检测呼吸道感染鲍曼不动杆菌TEM-1基因

目的建立一种快速、准确、特异、定时检测鲍曼不动杆菌TEM-1型β-内酰胺酶耐药基因的方法。方法选择TEM-1型β-内酰胺酶耐药基因作为靶序列,设计合成引物和探针;收集呼吸道感染患者痰标本培养的鲍曼不动杆菌279株,并对其进行检测分析。结果采用荧光聚合酶链反应检测鳗曼不动杆菌TEM-1耐药基因灵敏度为102拷贝,279株鲍曼不动杆菌中检出47株携带TEM-1基因,检出率为16.8%。结论应用Taqman探针荧光聚合酶链反应能够快速、准确检测鲍曼不动杆菌TEM-1型β-内酰胺酶耐药基因。

产ESBLs菌株的TEM型基因检测及其标本分布

目的了解我院ESBLs菌株中TEM型基因携带状况及其标本分布。方法采用PCR技术300例ESBLs菌株进行扩增,以双纸片协同法检测阴性菌株为对照。结果300株ESBLs菌株中TEM型基因阳性228株(76%),其中痰液、血液、尿液、分泌物及胆汁分离率为33.3%、17.5%、37.7%、8.3%及3.2%。结论TEM型ES-BLs是ESBLs菌株中主要型别,各种标本中都有较高的分离率。

小立碗藓细胞重新编程过程中染色体重塑观察

小立碗藓(Physcomitrella patens)是研究植物发育的理想模式植物,也是目前发现的具有高频率同源重组特性的植物,其再生能力很强。此研究以生长7d的小立碗藓原丝体、培养0d的原生质体和再生2d的原生质体为材料,旨在了解小立碗藓细胞重新编程过程中染色体结构的动态变化。透射电镜观察发现原丝体染色体结构浓缩程度高;而当原丝体脱去细胞壁成原生质体状态时,异染色质开始解凝,染色体结构变得较为松散;原生质体再生2d时其染色体松散程度次之。通过进一步荧光定量PCR分析染色体重塑相关基因SWI/SNF的表达水平,发现这些基因在原生质体中表达量最高。

深圳地区产超广谱β-内酰胺酶菌株的TEM基因分析

目的 了解本地区临床分离的产超广谱 β 内酰胺酶 (ESBLs)株携带TEM基因的情况。 方法 应用表型确证试验筛选产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。碱裂解法提取产酶株的质粒 ,应用PCR方法分析TEM基因。结果 2 15株产ESBLs菌株中TEM基因阳性 87株 ,阳性率为 4 0 .5 % ,其中产酶大肠埃希菌TEM阳性率为4 9 7% ,肺炎克雷伯菌阳性率为 18.8%。TEM型产酶株主要来源于痰和尿标本 (37.9%和 2 2 .0 % ) ,在肝胆外科、重症监护室和老年病科分布较多。结论 TEM型为本地区产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌常见的基因型 ,广泛分布于各临床科室 ,需引起重视。

Occurrence of Extended Spectrum Beta Lactamase Encoding Genes among Urinary Pathogenic <i>Escherichia coli</i>and <i>Klebsiella pneumoniae</i>Isolates Obtained from a Tertiary Hospital in Gombe Nigeria

This study was conducted to assess the occurrence and nature of extended-spectrum beta lactamase (ESBL) producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates from patients who presented with urinary tract infection at Federal Teaching Hospital Gombe. Isolates collected were recovered on MacConkey agar at 35°C and were identified as members of Enterobacteriaceae, and further screened for antimicrobial susceptibility and resistance by disc diffusion method. Isolates resistant to oxyimino-cephalosporins were confirmed as ESBL producers using Double Disks Synergy Test (DDST). The study shows 66% resistance to ceftriaxone (30 μg) in K. pneumoniae, which was the highest value recorded and a 51% resistance to cefpodoxime (10 μg) in E. coli. The sensitivity of E. coli and K. pneumoniae isolates to cefpodoxime (10 μg) were 49% and 33.9% respectively. ESBLs were detected among 40% (40/100) of E. coli and 54.13% (59/109) of K. pneumoniae isolates. Molecular characterization of ESBL encoding genes among E. coli isolates using multiplex-PCR showed 10% prevalence of SHV gene and 5% prevalence for CTX-M gene while TEM gene was not detected. In K. pneumoniae isolates, 5% prevalence was recorded for each of the three genes screened. The study revealed a co-occurrence of SHV and CTX-M in 75% of the E. coli and 70% of the K. pneumoniae isolates;the occurrence of all the three genes was seen in 10% and 5% of K. pneumoniae and E. coli respectively. Multiplex-PCR method provided an efficient and rapid detection of ESBL related genes, hence could be used in epidemiological studies among ESBL isolates. Monitoring dissemination and transmissions of ESBL producers are highly recommended for optimum patient care and preventing the spread of multidrug resistant (MDR) pathogens.

一种新型同时检测6种猪病毒病简化靶序列富集多重PCR的建立和初步应用

为建立一种新型同时检测6种猪常见病的方法,针对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)的保守基因,设计6对特异引物,在引物的5′端加上一段非同源性标签序列,再设计1对可识别标签序列的超级引物。通过优化反应条件,建立了6种猪常见病毒的简化靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)检测方法。灵敏度试验结果显示,该方法对PRV、JEV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV核酸的最低检测限度分别为4.36×103、2.21×103、2.69×103、3.18×103、2.63×104、3.12×104copies/L,而单重PCR检测的最低限度分别为1.3×101、2.59×102、8.03×101、3.29×101、2.65×101、2.45×102copies/L。该方法对54份临床样本的检测结果与国标单重PCR检测结果的一致性为94.9%。本试验建立的方法特异、灵敏、操作简便且成本低廉,对这6种猪病常见病原的同时检测有一定的参考意义。