基于PiggyBac转座系统的低溢漏诱导型Tet-On过表达体系的建立及应用

为避免诱导基因稳定表达的Tet-On诱导表达系统溢漏表达,实现简便且高效的外源基因稳定诱导表达,本研究拟在Tet-On调控的转录水平基础上,将基于稳定配体Shield-1的不稳定结构域FK506结合蛋白引入目的基因的N端,从蛋白水平控制其本底表达水平.为验证该系统的效果,本研究以荧光蛋白TdTomato为报告基因,经流式分析结果证明优化后的体系较原体系的溢漏表达在蛋白水平上降低7倍左右.将该系统应用于基于小鼠胚胎干细胞的体外牙向分化模型,在诱导因子Dox和稳定配体Shield-1的协同作用下,诱导表达牙齿发育相关转录因子Hand2提高了牙向分化诱导的完成度.

慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究

目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-GDNF与rt TA2sM2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体DA、DOPAC含量评估Lv-THGDNF治疗效应;通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果 1在体外He La细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。2在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善(P<0.01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高(P<0.01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-THGDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。

Tet-on系统诱导表达c-myc转基因小鼠的建立

从Hela细胞RNA中通过RT-PCR扩增出c-myc基因的cDNA,将c-myc cDNA克隆入Tet-on系统的反应元件pTRE2载体,与含有Tet-on系统的调控元件pBC-rtTA基因混合显微注射到FVB小鼠受精卵的雄原核中,共注射603枚卵,将注射后存活的263枚卵移植到21只假孕母鼠输卵管内,有17只怀孕,共产仔59只。PCR和Southern blotting检测有2只双基因阳性公鼠和1只c-myc单基因阳性公鼠。3只公鼠的F1代PCR检测表明,其携带的c-myc外源基因均具有遗传性。

慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内转移对帕金森病大鼠模型的保护作用

目的探讨慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因直接转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法将携带TH、GDNF基因并含启动子为Palb的四环素应答元件的慢病毒(Lv-TH-GDNF)和四环素反式作用子rtTA2s-M2病毒共同注射到SD大鼠左侧纹状体,用强力霉素(DOX)诱导大鼠目的基因GDNF和TH的表达。1周后在大鼠的同侧纹状体注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁纹状体的DA能神经元。通过旋转行为、黑质TH免疫组化染色以及高效液相色谱-电化学方法(HPLC-ECD)检测纹状体DA含量评估其保护效应;通过RT-PCR、免疫印迹观察Lv-TH-GDNF在脑内的表达。实验与健康对照组、磷酸缓冲液(PBS)对照组进行比较。结果在6-OHDA损伤后4周,Lv-TH-GDNF+rt-TA2s-M2+DOX组大鼠阿扑吗啡诱发的旋转效应均明显低于PBS对照组(P<0.01),损毁侧的的黑质区TH阳性细胞表达强度、纹状体DA含量均明显高于PBS对照组(P<0.01),但二者均低于健康对照组(P<0.01)。RT-PCR、免疫印迹结果显示,与PBS对照组比较,Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+DOX组大鼠纹状体TH、GDNF基因的表达明显增高(P<0.01)。结论慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内直接转移,在强力霉素诱导下可减缓6-OHDA诱发的大鼠DA能神经元进行性变性,具有保护作用。

Tet-On系统调控p53稳定表达的H1299细胞系的建立与应用

应用Tet-on系统和H1299细胞,建立了p53诱导表达的H1299细胞系p53-Tet H1299,p53表达受强力霉素(doxycycline,Dox)调控,存在一定的剂量依赖性。诱导表达的p53蛋白有很好的核定位能力和转录活性,能显著上调p21、TLR3、Bax等多种p53转录激活的下游靶基因表达,同时还可显著抑制水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)的复制,说明p53-Tet H1299可作为研究p53抗病毒作用的细胞模型。p53诱导表达细胞系的建立为进一步研究p53抗病毒作用机制、转录调控基因的筛选及其他生物学功能研究提供了很好的研究工具。

新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达

目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。

Tet-On调控HSVtk表达的重组腺相关病毒载体的构建和感染活性的检测

构建含有Tet基因调节系统及自杀基因HSVtk的重组腺相关病毒载体pAAV TRE HSVtk Tet_On ,并使用PCR技术和限制性内切酶消化进行鉴定。用构建好的重组质粒分别与辅助质粒pAAV_RC、pHelper以磷酸钙共沉淀法转染HEK2 93细胞,进行病毒包装后得到了AAV TRE HSVtk Tet_On重组腺相关病毒,以氯化铯密度梯度离心对包装好的病毒进行纯化。用纯化后的重组腺相关病毒感染乳腺癌细胞株MCF_7后,斑点杂交检测结果显示,HSVtk基因整合进入MCF_7细胞基因组中。有感染活性的重组腺相关病毒能将目的基因转移到宿主细胞中,在Dox诱导下,GCV对AAV感染的MCF_7细胞具有明显的杀伤作用。

EphA1基因可控性双稳转内皮祖细胞系EPCs^(Tet-On-EphA1)SiRNA的建立

目的建立可调控EphA1基因表达的内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA。方法将pWHE146质粒转染到内皮祖细胞系中,筛选出稳定表达的细胞克隆;扩增后瞬时转染pTRE-hyg-luc质粒,强力霉素诱导表达后,检测荧光素酶活性,挑选出高表达、低背景的受强力霉素调控的EPCsTet-On细胞株;再将重组质粒pTRE-EphA1SiRNA转染入EPCsTet-On细胞株,筛选出稳定表达细胞克隆EPCsTet-On-EphA1SiRNA;通过强力霉素诱导后,利用RT-PCR和Western blotting法检测EphA1基因mRNA与蛋白的表达。结果成功构建了受强力霉素调控的高表达低背景的EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株;强力霉素可诱导EPCsTet-On-EphA1SiRNA细胞株中EphA1mRNA表达下调,较之未调控组其差异有统计学意义(P<0.05);强力霉素调控EphA1蛋白表达的能力在一定范围内呈剂量依赖性关系。结论成功建立强力霉素调控EphA1基因表达的大鼠双稳转内皮祖细胞系EPCsTet-On-EphA1SiRNA,为深入研究EphA1基因在内皮祖细胞参与肝癌血管生成过程中的作用提供了有效的实验手段。

Tet-On基因表达系统定量调节荧光素酶基因在CHO细胞中的表达

目的：应用ＴｅｔＯｎ基因表达系统建立ＣＨＯＴｅｔＯｎ细胞株，通过强力霉素（Ｄｏｘ）调节荧光素酶基因的表达。方法：ｐＴｅｔＯｎ质粒转染ＣＨＯ细胞株，经Ｇ４１８筛选，得到稳定表达株ＣＨＯＴｅｔＯｎ。ｐＴＲＥＬｕｃ质粒瞬时转染ＣＨＯＴｅｔＯｎ克隆１至３０，培养基中加入２ｍｇ·Ｌ－１Ｄｏｘ或不加Ｄｏｘ，培养７２ｈ后检测荧光素酶活性。结果：克隆１８、２８、２９当培养基中加入Ｄｏｘ（即“Ｏｎ”状态）时荧光素酶活性高，当培养基中不加Ｄｏｘ（即“Ｏｆ”状态）时荧光素酶活性低，故选择克隆１８、２８、２９作为高表达、低背景的ＣＨＯＴｅｔＯｎ细胞株。结论：ＣＨＯＴｅｔＯｎ细胞株的建立，可利用四环素及其衍生物调节多种外源基因的表达，有效调控基因表达的时间和水平，定量诱导毒性蛋白的表达，增加治疗的疗效和安全性，有望为基因治疗提供一条可控的安全途径。

Tet-on基因表达系统反应质粒P^(TRE-HIF-1α)的构建和表达鉴定

目的克隆和构建携带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α。方法以缺氧的肝癌细胞株HepG2总RNA为模板,进行RT-巢式PCR,获得HIF-1α的cDNA,克隆入Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE2hyg,酶切重组子鉴定。将构建好的PTRE-HIF-1α用脂质体法转入HepG2Tet-on细胞,在强力霉素的作用下,用RT-PCR及Westernblot法鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1α的cDNA测序结果与Genbank记载完全一致,并成功克隆入PTRE2hyg,将反应质粒PTRE-HIF-1α转入HepG2Tet-on细胞,可以完整有效表达HIF-1α且受强力霉素的调控。结论成功克隆和构建携带HIF-1α基因的Tet-on基因表达系统反应质粒PTRE-HIF-1α,并证明其表达能在HepG2Tet-on细胞中受强力霉素调控。

利用Tet-On系统构建稳定表达Pdx1的小鼠ESC细胞株

目的:利用Tet-On系统构建稳定表达胰十二指肠同源异形框1(Pdx1)的小鼠胚胎干细胞(ESC)株,为进一步研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化奠定了基础。方法:采用Tet-On系统构建具有绿色荧光蛋白标记及嘌呤霉素抗性的Pdx1过表达慢病毒载体并感染胚胎干细胞。实验分为空白对照组(ESC组)、空载慢病毒对照组(PDX1−ESC组)和Pdx1慢病毒转染组(PDX1+ESC组)。流式细胞术检测多西环素(DOX)筛选后转染细胞的阳性率;检测Tet-On系统功能及Pdx1的mRNA和蛋白表达。流式细胞分选仪分选转染细胞,构建稳定表达Pdx1基因的ESC株及阴性对照ESC株。结果:(1)DOX筛选后PDX1−ESC组的转染细胞阳性率为90.72%,PDX1+ESC组的转染细胞阳性率为94.01%。用流式细胞分选仪分选后PDX1−ESC组的转染细胞阳性率为97.84%,PDX1+ESC组为98.13%。(2)加入DOX后,PDX1−ESC组和PDX1+ESC组可见绿色荧光。PDX1+ESC组Pdx1的mRNA和蛋白表达明显增高(P<0.05)。不加DOX,则3组细胞均未见绿色荧光,且Pdx1 mRNA和蛋白表达的差异无统计学显著性(P>0.05)。(3)细胞株冻存3个月后复苏培养仍然存活,并受DOX调控。结论:利用Tet-On系统成功构建可诱导表达Pdx1的小鼠ESC株,为研究Pdx1+定型内胚层细胞向胰腺细胞分化提供了有效的细胞模型。

重组Tet-on COLIA1基因腺病毒骨组织靶向表达对大鼠骨质疏松骨折愈合生物力学影响的实验研究

目的:研究重组Tet-on COLIA1基因腺病毒骨组织靶向表达对大鼠骨质疏松骨折愈合生物力学的影响。方法:40只健康雌性大鼠按照随机数字表法分为手术组(n=36)和假手术组(n=4)。手术组大鼠切除双侧卵巢,建立骨质疏松动物模型。假手术组大鼠仅切开皮肤,不切除双侧卵巢。手术组36只大鼠切除双侧卵巢3个月后,随机选取4只并处死,同时处死假手术组4只大鼠。收集其胫骨标本,采用双能X线测量假手术组和手术组大鼠的骨密度,以证实大鼠骨质疏松模型建立成功。随后,将剩余的32只手术组大鼠,采用薄电锯片从胫骨中段横行切断骨干,克氏针固定骨折断端,以构建大鼠骨质疏松骨折模型。同时按照随机数字表法分为4组:A组,重组Tet-on COLIA1基因腺病毒+强力霉素组;B组,重组Tet-on COLIA1基因腺病毒;C组,Tet-on空白腺病毒+强力霉素组;D组,空白对照组。分别于注射腺病毒6、8周后在电子万能材料试验机上进行胫骨三点弯曲试验。根据载荷-变形曲线计算骨折标本的生物力学参数,包括最大负荷、弹性模量、屈服点最大应力,同时采用micro-CT检测骨折愈合情况。结果:术后3个月手术组大鼠胫骨骨密度低于假手术组大鼠,且差异有统计学意义(P=0.005),表明大鼠骨质疏松模型制备成功。胫骨三点弯曲试验发现A组大鼠的最大负荷、弹性模量、屈服点最大应力,在腺病毒转染6、8周后,均高于B、C、D三组大鼠,且差异均有统计学意义(P<0.05)。Micro-CT显示,在转染6、8周后,A组大鼠骨折断端更加模糊,骨皮质较连续,骨折断端愈合更好。结论:经重组Tet-on COLIA1基因腺病毒转染的骨质疏松骨折大鼠,在强力霉素的作用下,能增加大鼠的最大载荷、弹性模量、屈服点最大应力,改善骨折愈合的能力,缩短骨折愈合的时间。

基于四环素调控系统的HD1BEL-7402 Tet-on细胞模型的建立

目的:建立表达四环素调控系统(Tet-on)的人肝癌细胞模型(HD1 BEL-7402 Tet-on),为研究四环素调控系统对基因的表达与调控提供一种细胞模型。方法:用四环素调控表达系统(Tet-on),通过脂质体法转染BEL-7402细胞,经G418筛选出高表达Tet-on的细胞株,PCR检测Tet-on基因整合,TRE-luc质粒瞬时转染含有Tet-on的细胞克隆,Dox诱导表达后,检测荧光素酶活性,筛选高诱导表达的抗性克隆,定名为HD1BEL-7402 Tet-on细胞。结果:建立了高效诱导表达的HD1 BEL-7402 Tet-on细胞模型。结论:建立的细胞模型为以后转染TER-x质粒(如GFP),研究任何感兴趣的目的基因的调控打下了基础。

Adeno-X Tet-On系统调控LacZ基因在雪旺细胞中表达的研究

目的 应用Adeno XTet On系统感染雪旺细胞 ,通过四环素衍生物强力霉素 (doxcycline ,Dox)调控LacZ基因产物 (βgal)的表达。方法 ①取生后 5～ 6dSD仔鼠坐骨神经进行雪旺细胞培养 ,并进行形态学及S 10 0蛋白相关抗原免疫组织化学染色鉴定。②将Adeno XTet OnVirusStock与Adeno XTRE βgalVirusStock分别感染HEK2 93细胞 ,收获病毒并作滴度测定。③将扩增后的病毒感染雪旺细胞并绘制Dox调控下βgal诱导表达曲线。结果 ①由体外培养获得的雪旺细胞纯度可达 90 %以上并且状态良好 ,免疫组织化学染色阳性结果明显。②扩增后的病毒滴度较高 ,分别达 1.2 6× 10 9、1.99× 10 9pfu/ml。 结论 将病毒感染雪旺细胞后 ,经检测发现DOX对

Tet-On调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤

背景:肾缺血再灌注损伤是诱发急性肾损伤的主要原因。骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤一直是研究的热点。目的:探讨Tet-On系统调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞(NICD-Tet-BMSCs)对肾缺血再灌注损伤的修复作用。方法:采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,体外构建Tet-On系统强力霉素调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞,然后将此细胞移植至肾缺血再灌注损伤大鼠体内,术后检测血清肌酐水平、肾组织中骨髓间充质干细胞分布以及血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α表达变化。结果与结论:(1)NICD蛋白在NICD-Tet-BMSCs中稳定表达并受强力霉素调控;(2)与肾缺血再灌注损伤组相比,NICD-Tet-BMSCs组大鼠术后血清肌酐水平明显降低(P<0.05);(3)外源性骨髓间充质干细胞在NICD-Tet-BMSCs组大鼠肾组织中增殖持续时间更长;(4)NICD-Tet-BMSCs组肾组织中血管内皮生长因子蛋白表达升高,肿瘤坏死因子α蛋白表达降低,差异有显著性意义(P<0.05);(5)体外能够成功构建Tet-On系统调控NICD稳定表达的大鼠骨髓间充质干细胞,此细胞可促进大鼠肾缺血再灌注损伤的修复。

Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建

目的构建Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为体外扩增造血干细胞并保持其干细胞特性提供实验材料基础。方法应用PCR技术从质粒TAT-HA-HOXB4-Full中扩增编码人HOXB4的cDNA,用限制性内切酶EcoRI分别酶切HOXB4基因片段和带有Tet-on开关的可调控慢病毒载体,经T4DNA连接酶连接获得慢病毒载体Teto-Fuw-hHOXB4。对构建的HOXB4慢病毒载体进行酶切片段凝胶电泳及DNA测序分析。结果酶切片段电泳分析和DNA测序分析证明Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建成功。结论正确构建了Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为后续的体外扩增造血干细胞及相关研究提供材料。

Tet-on诱导表达c-myc和SV40Tag的转基因小鼠肿瘤模型

目的研究Tet-on诱导表达c-myc和SV40Tag小鼠肿瘤模型的肿瘤发生和基因表达情况,探讨c-myc基因的作用。方法用pTRE2-c-myc单阳性转基因小鼠和Tet-on、pTRE2-SV40Tag双阳性转基因小鼠交配,后代检测得到Tet-onp、TRE2-SV40Tag、pTRE2-c-myc三阳性转基因小鼠,经强力霉素诱导一段时间以后,观察肿瘤的发生;通过RT-PCR、病理组织切片和磁共振等方法对肿瘤的发生部位和时相进行研究。结果Tet-on、pTRE2-SV40Tag、pTRE2-c-myc三阳性转基因小鼠①经诱导后发生肿瘤,且发瘤率和发瘤时间高于和短于Tet-on、pTRE2-SV40Tag双阳性转基因小鼠;②c-myc和SV40Tag基因在表达部位上有所不同。结论c-myc和SV40Tag基因同时表达与SV40Tag基因单独表达时相比,肿瘤发生明显增强,提示c-myc基因与肿瘤的发生有着密切关系。

Tet-on Advanced调控Amelotin基因表达成釉细胞系的建立

目的应用Tet-on Advanced基因表达系统构建由强力霉素(Dox)诱导Amelotin基因表达的成釉细胞系,为进一步研究Amelotin基因的生物学功能奠定基础。方法通过RT-PCT法从出生后7d的小鼠牙胚中克隆得到Amelotin的全长基因,测序正确后将其亚克隆入pTRE-Tight载体中,利用Tet-on Advanced基因表达系统先后将调控质粒pTet-on Advanced和反应质粒pTRE-Tight-Amelotin转入成釉细胞,分别用G418和潮霉素进行筛选,克隆扩增得到可诱导表达Amelotin基因的成釉细胞系。用RT-PCR法检测不同Dox浓度下转染成釉细胞中Amelotin基因的表达。结果连续两个回合的转染及筛选后获得了引入pTet-on Advanced系统的细胞系,能够高诱导低背景表达Amelotin,在强力霉素诱导48h可以使Amelotin的表达显著增加,强力霉素在一定浓度范围内可以诱导Amelotin的表达呈剂量依赖性增加。结论成功构建了受强力霉素调控的双重稳定表达Amelotin成釉细胞系,为进一步研究Amelotin与釉质矿化之间的关系奠定了基础。

利用Tet-on系统构建调控APP_(swe)基因表达的SH-SY5Y细胞模型

目的利用Tet-On诱导可调控系统构建表达淀粉样前体蛋白突变基因(APPswe)细胞模型。方法构建重组质粒p TRE-APPswe-Flag,利用慢病毒将其包装转染SH-SY5Y细胞。Puromycin筛选72 h后,通过强力霉素诱导,Western blot检测验证,免疫荧光检测APPswe表达情况。结果强力霉素诱导后,筛选的细胞Western blot检测Flag标签蛋白表达明显,免疫荧光显示APPswe蛋白表达增加;撤掉强力霉素后,APPswe蛋白表达减少。结论成功构建了可调控Tet-OnAPPswe表达SH-SY5Y细胞系统模型。

基于Tet-on系统的RFP基因表达载体构建及功能验证

【目的】构建四环素诱导表达调控系统的表达载体,并对其功能进行验证。【方法】利用pTRE-tight和pdsred-Express2-N1构建带有红色荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)基因的载体pTRE-DSred,用其与另一载体pTet-on共转染293T细胞,并加入不同质量浓度(0,0.1,1,10μg/mL)的强力霉素(doxycycline,DOX)诱导,以未经质粒转染的293T细胞为对照组,在荧光显微镜下观察RFP基因的表达情况。【结果】成功构建了pTRE-DSred重组质粒,将其与pTet-on质粒共转染293T细胞,在细胞培养液中分别添加0.1,1,10μg/mL DOX,48h后均有红色荧光蛋白的表达,但10μg/mL DOX组红色荧光蛋白的表达水平明显低于前2个组;0μg/mL DOX诱导组中也有红色荧光蛋白表达,但水平极低;在未转染质粒对照组中未观察到红色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,pTREDsred和pTet-on共转染组均检测到RFP基因的转录。【结论】成功构建了Tet-on系统RFP基因表达载体,适宜质量浓度的DOX诱导有助于目的基因的高水平表达,但在不添加DOX诱导剂时,该Tet-on系统存在目的基因低渗漏表达现象。