Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建

目的构建Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为体外扩增造血干细胞并保持其干细胞特性提供实验材料基础。方法应用PCR技术从质粒TAT-HA-HOXB4-Full中扩增编码人HOXB4的cDNA,用限制性内切酶EcoRI分别酶切HOXB4基因片段和带有Tet-on开关的可调控慢病毒载体,经T4DNA连接酶连接获得慢病毒载体Teto-Fuw-hHOXB4。对构建的HOXB4慢病毒载体进行酶切片段凝胶电泳及DNA测序分析。结果酶切片段电泳分析和DNA测序分析证明Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建成功。结论正确构建了Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为后续的体外扩增造血干细胞及相关研究提供材料。

过表达Sox2基因可增强人骨髓干细胞向神经元分化（英文）

目的:研究Sox2对于人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经元跨分化能力的影响。方法:利用Western Blot检测hBMSCs中Sox2、Oct4和c-Myc的表达,将携带Sox2和rhGFP编码序列的Tet-On慢病毒感染hBMSCs,通过多西环素(Dox)处理10 d诱导Sox2和rhGFP表达;利用神经诱导培养基诱导感染慢病毒的hBMSCs分化,通过免疫荧光染色技术检测神经元标记物Tuj1的表达;利用Western Blot技术检测Smad 2/3信号通路蛋白在hBMSCs向神经元分化过程中的表达水平。结果:Western Blot结果显示hBMSCs不仅表达Sox2和Oct4,同时还表达c-Myc;光镜下发现Sox2的过表达促进hBMSCs的形态向神经元样细胞转化,同时通过免疫荧光染色发现Tuj1的表达水平增加; Western Blot证实Sox2基因过表达引起hBMSCs中磷酸化Smad 2/3的表达水平降低。结论:Sox2可通过Smad 2/3信号通路增强人骨髓间充质干细胞向神经元分化。

可稳定表达ZsGreen1基因的正常细胞来源单核细胞株的构建

为探索构建可表达外源基因的正常细胞来源单核细胞株的可行方案,该研究分别尝试以脂质体转染法、腺病毒载体感染法和含Tet-On调控元件的慢病毒载体感染法,构建可表达绿色荧光蛋白的SC细胞株。经慢病毒感染和靶向扩增获得稳定表达目的基因的SC细胞后,该研究进而验证了该细胞可否在PMA诱导下分化为典型的巨噬细胞。研究结果显示,脂质体转染法和腺病毒载体感染法未能有效导入外源基因至SC细胞;经慢病毒感染和靶向扩增,该研究成功构建了2株可稳定表达ZsGreen1基因的SC细胞株(SC-ZsGreen1),其ZsGreen1阳性表达率均高于95%; SCZsGreen1细胞与SC细胞经PMA处理后均具相似的巨噬细胞表型特征,包括CD11b和CD14表达升高、吞噬能力上调和趋化因子IL-8分泌水平上升。综上,该研究报道了一种构建可稳定表达外源基因的正常人外周血来源单核细胞株的可行方案。