慢性尼古丁成瘾大鼠脑组织中Tet1蛋白水平及Npas4基因甲基化水平研究

目的探讨慢性大鼠尼古丁成瘾过程中Tet1蛋白表达水平及Npas4基因甲基化水平变化及意义。方法通过背部连续注射尼古丁酒石酸氢盐构建大鼠慢性尼古丁成瘾动物模型,应用Western blot对各组实验大鼠脑组织Tet1蛋白表达水平进行测定;应用选择性化学标记SMRT测序对大鼠海马区域及大脑皮质中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)与5-甲基胞嘧啶(5mC)水平进行测定,获得5hmC与5mC在脑内的动态变化;应用甲基化特异性PCR(MSP)结合RT-PCR对大鼠海马区、大脑皮质中Npas4基因甲基化、mRNA和蛋白表达情况进行测定;应用荧光分光光度法对慢性尼古丁成瘾大鼠脑内神经递质多巴胺(DA)、乙酰胆碱(AC)、阿啡肽(EOPs)及五羟色胺(5-HT)含量进行测定。结果通过构建慢性尼古丁成瘾大鼠动物模型应用Western-blot对各组大鼠脑内Tet1蛋白表达水平测定结果发现,在大鼠海马区中尼古丁成瘾组大鼠Tet1蛋白表达水平明显低于非尼古丁成瘾大鼠(P<0.05),进一步对5hmC与5mC水平测定发现,大鼠海马区中尼古丁成瘾大鼠组出现5hmC显著下降而5mC明显升高(P<0.05);通过对Npas4基因甲基化及mRNA及蛋白表达水平进行测定发现,在大鼠海马区域中尼古丁成瘾大鼠脑内Npas4基因呈现高甲基化情况,而Npas4基因mRNA及蛋白表达水平下调(P<0.05);对各组大鼠脑内神经递质浓度检测发现,大鼠海马区中尼古丁成瘾组大鼠脑内神经递质浓度多巴胺(DA)、乙酰胆碱(AC)、内啡肽(EOPs)及五羟色胺(5-HT)均高于非尼古丁成瘾大鼠组(P<0.05)。结论在大鼠慢性尼古丁成瘾形成过程中大鼠脑组织海马区Tet1蛋白表达水平下降,且可以影响大鼠脑组织中5hmC与5mC水平,进而影响Npas4基因甲基化程度及神级递质变化从而参与尼古丁成瘾的形成。

TET1蛋白去甲基化作用及其对肿瘤影响的研究进展

TET(ten eleven translocation)家族蛋白是DNA甲基化过程中的重要调节因子,包括TET1、TET2和TET3,属于α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+依赖的双加氧酶。TET蛋白能将5-甲基胞嘧啶(5mC)氧化生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),是TET蛋白发挥去甲基化作用的基础。TET蛋白对胚胎发育、生殖细胞形成及骨髓造血等具有重要作用。TET1蛋白在癌细胞和癌组织中的含量明显低于癌旁组织,提示TET1蛋白的DNA去甲基化作用对肿瘤的发生、发展具有一定影响。文章综述TET1蛋白发挥去甲基化作用的机制及其在肝癌、胃癌和结肠癌等中的最新研究进展,为肿瘤的预后和治疗作参考。

TET1蛋白对乳腺癌细胞株MDA-MB-453增殖的影响

目的探讨TET1蛋白对乳腺癌细胞株MDA-MB-453增殖的影响.方法将TET1的稳转细胞株(MDA-MB-453-TET1)和其阴性对照组稳转细胞株(MDA-MB-453-NC)通过慢病毒载体构建出来,采用RNA的反转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)及蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测TET1的表达情况.细胞增殖实验(CCK-8法)检测细胞增殖;Western blot检测上皮间充质转化(EMT)相关蛋白[上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-链蛋白(β-catenin)]的呈现.结果阴性对照组与空白对照组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05).MDA-MB-453-TET1组E-cadherin(2.98±0.11)、TET1 mRNA(5.36±0.02)及TET1(12.3±0.41)均显著高于阴性对照组的(0.98±0.21)、(1.25±0.08)、(4.21±0.09)与空白对照组的(0.95±0.2)、(1.23±0.04)、(4.19±0.10),N-cadherin(0.08±0.02)、Vimentin(4.41±0.18)、β-catenin(0.05±0.002)均低于阴性对照组的(0.10±0.01)、(9.98±0.52)、(0.11±0.02)与空白对照组的(0.11±0.02)、(9.97±0.45)、(1.23±0.04),差异均有统计学意义(P<0.05).阴性对照组与空白对照组OD值比较,差异无统计学意义(P>0.05).MDA-MB-453-TET1组OD值低于阴性对照组与空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论TET1可抑制MDA-MB-453细胞增殖,其机制可能与通过Wnt/β-catenin通路抑制EMT的发生相关.

DNA双加氧酶TET家族蛋白1抑制上皮性卵巢癌转移的作用机制研究

目的探讨TET家族蛋白1(TET1)在调控上皮性卵巢癌(EOC)转移中的作用机制。方法在EOC细胞系中瞬时转染TET1过表达质粒,通过Transwell实验检测EOC细胞迁移能力变化。通过蛋白质免疫印迹检测上皮细胞黏附分子(EpCAM)的表达。通过蛋白质免疫荧光实验检测EpCAM上游转录因子β-连环蛋白的亚细胞定位变化。检测β-连环蛋白的上游抑制因子叉头框基因O4(FOXO4)基因启动子区5hmC和5mC含量变化。通过染色质免疫共沉淀实验检测TET1与FOXO4基因启动子区域结合情况。利用EOC组织芯片对TET1与β-连环蛋白进行免疫组织化学染色,探讨二者表达的相关性。结果过表达TET1明显抑制EOC细胞系OVSAHO和JHOS4的细胞迁移能力,且明显抑制EpCAM的表达。TET1过表达后促进β-连环蛋白的亚细胞定位发生变化,其核内聚集明显减少,β-连环蛋白与EpCAM基因启动子区域结合亦明显减少。TET1过表达可以促进FOXO4的表达,进而抑制β-连环蛋白进入细胞核发挥转录因子作用。当FOXO4表达被敲低后,β-连环蛋白的细胞核内分布明显增加。在浆液性卵巢腺癌组织样本中,71.8%(28/39)TET1表达呈阳性,15.4%(6/39)β-连环蛋白表达呈阳性,TET1与β-连环蛋白的表达呈负相关(χ^(2)=4.745,P=0.030)。结论TET1通过调控FOXO4/β-连环蛋白/EpCAM轴抑制EOC转移。

糖尿病肾病大鼠肾组织MMP-9表达及意义

目的探讨基质金属蛋白酶9(MMP-9)在糖尿病肾病发生、发展中的作用。方法将60只Wistar大鼠随机分为两组,对照组24只、模型组36只,模型组一次性腹腔注射链脲佐菌素(150 mg/kg)制备糖尿病模型,成模24只;对照组注射等量的柠檬酸缓冲液。给药1、2、4、8周时,两组分别随机选择6只大鼠,取其肾组织观察病理学变化,标本行HE染色,采用免疫组化法检测肾组织MMP-9表达,计数每个肾小球内MMP-9染色阳性的足细胞(MMP-9阳性足细胞)数量。采用RT-PCR法检测肾组织TET1蛋白、活化因子蛋白1(AP-1)mRNA相对表达量。结果模型组给药1、2、4、8周时可见肾小球体积逐渐增大,基底膜逐渐增厚,毛细血管袢逐渐扩张,伴随肾小管扩张或萎缩,可见轻度纤维化。对照组给药1周时MMP-9阳性足细胞数量为(0.47±0.31)个;模型组给药1、2、4、8周时MMP-9染色阳性足细胞数量分别为(2.75±1.29)、(4.59±1.63)、(7.95±2.36)、(15.61±2.77)个,呈逐渐增高趋势,且均高于对照组,组间及组内比较P均<0.05。模型组给药后1、2、4、8周时肾组织AP-1、TET1相对表达量呈逐渐增高趋势,且均高于同时间点对照组,组间及组内比较P均<0.05。结论 MMP-9高表达参与了糖尿病肾病的发生、发展,激活AP-1、TET1基因可能是其作用机制。

肝母细胞瘤细胞中STAT3异常表达的DNA甲基化分子机制研究

目的探讨肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)肿瘤组织中信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator oftranscription 3,STAT3)高表达的DNA甲基化机制。方法以湖南省儿童医院普外一科于2016年5月至2019年3月收治的20例HB患儿为研究对象,其中男12例,女8例,中位年龄为33个月,年龄范围为3~72个月;3例甲胎蛋白含量<3000μg/L,17例甲胎蛋白含量>3000μg/L;7例为胎儿型HB,7例为胚胎型HB,1例为未分化型HB,5例为混合型HB;按HB的PRETEXT分期系统分期,Ⅰ期3例,Ⅱ期6例,Ⅲ期6例,Ⅳ期5例。手术切取HB肿瘤及癌旁正常组织,肿瘤组织的切除范围参照术前影像学检查结果,并扩大1~2 cm切除,癌旁正常组织需切取离肿瘤边缘至少2 cm的正常组织。将肿瘤组织作为实验组,癌旁正常组织作为对照组。采用实时定量聚合酶链反应(quantificational real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)及蛋白质印迹法检测实验组和对照组中STAT3和TET的表达水平。采用亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)技术检测实验组和对照组中STAT3启动子区DNA甲基化水平。使用染色质免疫共沉淀(chromatin Immunoprecipitation,ChIP)-定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)检测实验组和对照组中STAT3启动子区TET1结合水平,并将实验组中TET1结合水平与STAT3启动子DNA甲基化水平做相关性分析。结果在两组间STAT3的表达水平差异方面,qRT-PCR检测结果显示,实验组与对照组STAT3的表达水平相比(8.43±5.05比1.03±0.41),实验组STAT3的表达水平显著升高,差异具有统计学意义(t=-6.53,P<0.001);蛋白质印迹法检测证实了实验组STAT3表达水平的上调,实验组与对照组相比(0.96±0.17比0.37±0.13),差异具有统计学意义(t=-12.13,P<0.001)。在两组间STAT3启动子DNA甲基化水平的差异方面,BSP检测结果显示,实验组与对照组STAT3启动子区DNA甲基化水平相比(0.52±0.10比0.82±0.06),实验组STAT3启动子区DNA甲基化水平显著降低,差异具有统计学意义(t=11.73,P<0.001)。实验组的STAT3 mRNA水平与其启动子区DNA甲基化水平的相关性分析结果显示,STAT3 mRNA水平与其启动子区DNA甲基化水平呈显著负相关,差异具有统计学意义(r=-0.704,P=0.001)。qRT-PCR检测显示实验组与对照组TET的表达水平相比(4.81±2.25比1.10±0.42),实验组TET1表达水平明显上调,差异具有统计学意义(t=-7.227,P<0.001);两组间TET2和TET3的表达差异无统计学意义,实验组与对照组TET2表达水平为1.33±0.54比1.07±0.46(t=-1.624,P=0.113),TET3表达水平为1.77±1.03比1.33±0.89(t=-1.43,P=0.161)。蛋白质印迹法检测结果显示实验组与对照组TET1表达水平相比(0.77±0.18比0.27±0.09),实验组TET1表达水平增加,差异具有统计学意义(t=-11.392,P<0.001)。在两组间STAT3启动子区TET1的结合水平方面,ChIP-qPCR结果显示,实验组与对照组相比(3.72±1.47比1.28±0.73),实验组STAT3启动子区TET1结合水平显著升高,差异具有统计学意义(t=-6.63,P<0.001)。实验组STAT3启动子区TET1结合水平与STAT3启动子区DNA甲基化水平的相关性分析结果显示,实验组STAT3启动子区TET1结合水平与DNA甲基化水平呈显著负相关,差异具有统计学意义(r=-0.658,P<0.01)。结论HB患儿肿瘤组织中TET1的表达升高可能是导致STAT3启动子DNA低甲基化,进而过度表达的原因之一。