H3N2流感病毒HA保守Th表位对CD4^(+)T细胞活化及分化的影响

目的探讨H3N2病毒HA保守Th表位对CD4^(+)T细胞活化及分化的影响,为后续研究通用流感疫苗奠定基础。方法利用NetMHCⅡpan-4.0软件预测H3N2疫苗株A/Kansas/14/2017 HA的Th表位,以IC 50<500 nM为标准筛选阳性预测表位;采用SWISS-MODLE对A/Kansas/14/2017 HA进行同源建模,在3D模型上定位保守Th表位,根据表位的亲和力、保守性及核心序列的位置筛选高保守表位;合成6个非重叠的高保守Th表位,用保守Th表位体外刺激健康人外周血单核细胞,流式细胞术分析CD4^(+)T细胞表面分子CD69及细胞因子IFN-γ、IL-4的表达。结果在A/Kansas/14/2017 HA中共筛选到48个阳性预测Th表位,其中33个在H3-HA中是保守的;成功构建A/Kansas/14/2017 HA 3D模型,27个保守Th表位位于HA头部,其余6个位于杆部;人外周血PBMC经保守Th表位刺激后,CD69分子表达增加,细胞因子IFN-γ和IL-4合成增加。结论筛选到的6个H3N2 HA高保守Th表位具有免疫原性,可刺激CD4^(+)T细胞活化及分化。

兔出血症病毒VP60抗原优势区和Th细胞表位融合蛋白的原核表达及免疫效力测定

为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60两个抗原优势区串联通用Th细胞表位的融合蛋白AB-Th的免疫效力,本研究采用融合PCR的方法以pBL-RHDV为模板扩增AB-Th基因并亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,大量表达AB-Th融合蛋白。结果显示,融合蛋白以包涵体形式表达,并且具有良好的免疫原性。使用纯化后的融合蛋白免疫实验兔,并分别利用ELISA方法和MTS法检测兔免疫后的抗体水平和淋巴细胞增殖能力。结果表明该融合蛋白能够使兔产生针对RHDV VP60蛋白的特异性抗体和导致高水平的淋巴细胞增殖,并能够为实验兔提供100%的保护。

戊型肝炎病毒颗粒性蛋白疫苗H-2^d限制性Th表位的筛选

戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原HEV239能形成类病毒颗粒，具备演变成多价疫苗的载体的潜力，此文旨在筛选、鉴定其内包含的H-2^4限制性Th表位。以50μg HEV 239蛋白与完全弗式佐剂混合后皮下免疫BALB／c鼠，以覆盖HEV 239蛋白全长的15氨基酸肽库体外刺激其脾细胞，用IFN-γ-ELISPOT方法检测其细胞免疫应答，并通过磁珠剔除脾细胞中CD4^＋ T细胞或CD8^＋ T细胞以分析筛选得到的T细胞表位的特性。结果显示：HEV239中包含优势的T细胞表位P34（HEV PORF2 AA533～AA547，HSKTF FVLPL RGKLS）及数个较弱的T细胞表位。P34对HEV 239免疫的BALB／c鼠脾细胞的刺激效果与HEV 239蛋白相当，剔除实验表明该表位为CD4^＋T细胞表位，即Th表位。

戊肝病毒Th表位肽免疫可增强其载体蛋白的体液免疫应答

戊型肝炎病毒衣壳蛋白内包含一个强H-2d限制性Th表位P34。以该表位肽免疫BALB/c鼠,其脾细胞能够在体外识别重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白,剔除实验表明应答细胞几乎完全是CD4+T细胞,证明P34表位肽能有效诱导产生特异性Th细胞。以P34肽初免小鼠,再以包含该表位的重组戊型肝炎病毒抗原(E2)免疫,结果表明,10μg、20μgE2免疫组在免疫后第1周即有部分小鼠产生抗体,到第3周所有小鼠均能够产生抗体;而对照肽P18初免的小鼠,以20μgE2加强免疫亦无法诱导小鼠产生抗体。这表明,Th表位肽P34初免诱导产生的Th细胞能够有效促进小鼠对携带该表位的载体蛋白的体液免疫应答。

一种新的病毒蛋白Th细胞表位预测方法

调查了病毒蛋白６３个Ｔｈ细胞表位以分析其氨基酸顺序特征。一个由５个氨基酸组成的模板出现于９６％的表位中。将此模板应用于ＨＢｓＡｇ／Ｐ２５（ａｙｗ）和Ｐｒｅ－Ｓ＿（２）蛋白（ａｄｒ，ａｙｗ，ａｄｗ＿２）的Ｔｈ细胞表位预测，发现所有已经实验证实的表位均可由该模板识别出，提示该模板可能是病毒蛋白Ｔｈ细胞表位的一种重要顺序特征，并可应用于病毒蛋白Ｔｈ细胞表位的预测中。

复合通用CD4^+Th细胞表位基因的原核表达及免疫学特性

目的构建复合通用CD4+Th细胞表位基因的原核表达载体,检测表达蛋白的免疫学特性,并探讨其作为载体蛋白的可能性。方法以限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUC19-Pep10,回收长度为650bp左右的目的片段,插入原核表达载体pQE30中,获得重组质粒pQE30-Pep10,转化大肠杆菌M15后进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westernblot分析后,进行亲和层析纯化及透析复性,获得重组蛋白Pep10,将Pep10和TT分别免疫雌性BALB/c小鼠,以间接ELISA法和流式细胞术分别检测其免疫原性和淋巴细胞增殖效应。结果SDS-PAGE显示重组蛋白Pep10相对分子质量约为23000,表达量达41%,主要以包涵体形式表达,Westernblot检测可见特异性染色条带,纯化后纯度达94%,共获得42mg重组蛋白。其体外淋巴细胞增殖效应与TT相当,增殖指数分别为4.216和4.736,而免疫原性远低于TT,特异性IgG几何平均滴度(GMT)分别为1∶15758.65和1∶67558.81。结论已成功构建重组原核表达载体pQE30-Pep10,并在大肠杆菌中高效表达,且表达的重组蛋白Pep10具有良好的淋巴细胞增殖效应和较低的免疫原性,有可能作为一种新型载体蛋白,用于多糖结合疫苗的研制。

单纯疱疹病毒Ⅰ型的Th细胞和B细胞表位重组核酸疫苗的构建及真核表达

目的构建单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)糖蛋白B(g B)和糖蛋白D(g D)的Th细胞和B细胞表位重组串联核酸疫苗,并鉴定其真核表达。方法利用生物信息学分析软件预测HSV-1 g B和g D的Th细胞表位和B细胞表位,结合已发表文献,设计合成HSV-1的Th细胞和B细胞表位重组串联抗原基因(Th/B基因)。将Th/B基因定向克隆入真核表达载体p VAX1,构建真核表达质粒p VAX1-Th/B。用制备的质粒转染COS-7细胞,裂解细胞后经Western blot鉴定其蛋白表达。结果预测得到了HSV-1 g B和g D的Th细胞和B细胞表位,成功构建真核表达质粒p VAX1-Th/B,经测序确认序列正确。SDS-PAGE分离出相应大小的蛋白表达片段,经Western blot鉴定并证实该重组核酸疫苗能够在体外真核细胞中表达。结论成功构建HSV-1 Th细胞和B细胞表位重组串联核酸疫苗,并能够在体外真核细胞中表达,为HSV-1核酸疫苗的进一步研究打下基础。

HBV新型免疫原的设计、合成及免疫原性研究

目的 探讨如何将表位构建成有效免疫原。方法 以Pre S( 2 ) 蛋白两优势性B细胞表位和HBcAg两Th细胞表位为基础 ,设计、合成了 2种MAP多肽 ,以此两MAP肽为免疫原免疫兔和小鼠 ,观察体液免疫反应。结果 此两种MAP多肽均比Pre S( 2 ) 蛋白诱发更高抗体滴度 ;Th细胞表位引入可显著增强反应强度。结论 增加肽抗原结构复杂性可提高其免疫原性 ,其表位排列以B细胞表位在赖氨酸核心外侧为佳 。

复合T辅助细胞表位基因质粒的构建及测序

目的制备复合T辅助细胞表位基因。方法复合T辅助细胞表位由5个T辅助细胞表位组成(结核杆菌热休克蛋白65p120、风疹蛋白E2-4p5465、人工合成T辅助细胞表位PADRE、沙眼衣原体热休克蛋白60p3548、破伤风类毒素p830843),其基因序列由219个核苷酸组成。人工合成4条69bp的DAN片段,各片段首尾之间有19bp的互补序列,应用DNA互补延伸拼接技术将4条DNA片段拼接成复合T辅助细胞表位,通过克隆、测序进行筛选。结果通过人工合成基因片段,应用DNA互补延伸拼接技术,成功制备了219个碱基的复合T辅助细胞表位基因,构建了复合T辅助细胞表位基因质粒。结论复合T辅助细胞表位基因的成功制备为研究复合T辅助细胞表位高效疫苗奠定了基础。

重组产气荚膜梭菌ε毒素三点突变体的融合表达及其免疫活性分析

为获得并评价重组产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)三点突变体蛋白的毒力及免疫活性,对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因进行优化设计,同时引入包括第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,及第106位组氨酸突变为脯氨酸共3个氨基酸突变,并在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNETXm3。随后,将该基因片段克隆至原核表达载体p ET30a-(+),转染BL21(DE3)菌诱导表达、纯化,从而获得重组蛋白,进而利用Western blot方法检测重组蛋白与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性,并检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)及小鼠的毒力。最后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。结果显示,重组蛋白主要以包涵体的形式存在,且能与D型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;100μg/m L的重组蛋白未显示细胞毒性;6.25 mg/kg剂量的重组蛋白对小鼠无致死性;每毫升的一免抗血清可中和80~120个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和750~1100个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。试验表明,产气荚膜梭菌ETX三点突变体的毒力基本消失,且保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。

重组产气荚膜梭菌β毒素突变体的表达与免疫保护性分析

旨在获得产气荚膜梭菌β毒素(CPB)的重组突变体,并评价其毒力及免疫保护性。对已知的产气荚膜梭菌CPB编码基因进行优化设计,同时引入4个氨基酸突变位点,分别是第212位的精氨酸突变为谷氨酸,第268位的亮氨酸突变为甘氨酸,266位的酪氨酸和275位的色氨酸突变为丙氨酸。此外,在该基因5′端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端的编码序列,经人工合成获得重组基因片段(GTF_(N)CPB_(m4))。将GTF_(N)CPB_(m4)克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF_(N)CPB_(m4)。利用Western blot方法检测rTF_(N)CPB_(m4)与C型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性,并检测rTF_(N)CPB_(m4)对小鼠的毒力。随后,以rTF_(N)CPB_(m4)免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。结果表明,rTF_(N)CPB_(m4)主要以包涵体的形式表达且能与C型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。小鼠安全性试验显示,50μg的rTF_(N)CPB_(m4)对小鼠仍无致死性;免疫rTF_(N)CPB_(m4)后,每毫升家兔二免抗血清可中和10~20个小鼠最小致死量(MLD)的C型产气荚膜梭菌毒素;1个家兔MLD的C型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rTF_(N)CPB_(m4)在丧失毒力的同时保留了良好的免疫原性,从而为C型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的数据。

重组产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达与免疫保护力评价

为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变。此外,在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNCPAm4。将GTFNCPAm4克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTF_NCPA_(m4)。利用Western blot方法检测rTF_NCPA_(m4)与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并检测该蛋白的卵磷脂酶和溶血活性以及对小鼠的毒力。随后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化,免疫家兔,检测兔血清的中和抗体效价。二免后21 d,对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rTF_NCPA_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rTF_NCPA_(m4)主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素产生血清反应;体外实验显示,rTF_NCPA_(m4)无卵磷脂酶和溶血活性;小鼠安全性实验显示,5.5 mg/kg剂量的rTF_NCPA_(m4)对小鼠无致死性;免疫重组蛋白后,每毫升的一免抗血清可中和10个MLD、二免抗血清可中和40个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上数据说明,表达的CPA重组突变体蛋白具有良好的安全性和免疫原性,为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的实验数据。

日本血吸虫童虫期体被蛋白Th细胞表位预测及初步鉴定

目的预测并鉴定日本血吸虫童虫体被蛋白分子的Th细胞表位。方法利用在线服务器分别对有关序列进行跨膜区与信号肽的预测分析;采用结合基序扫描与计分矩阵等算法,以及基于多种分子动力学算法的配体受体相互对接的分子建模方法等进行Th细胞表位预测;人工合成肽采用以多聚赖氨酸为核心的含4个表位肽分支臂的复合抗原多肽;表位肽刺激免疫鼠脾淋巴细胞增殖效果的鉴定采用改良的MTT法。结果从373条日本血吸虫肝期童虫体被蛋白序列中筛得14条具有开放阅读框及信号肽结构的序列;预测得到至少与小鼠的1个MHCⅡ类分子结合的5个15肽表位序列;淋巴细胞增殖试验初步鉴定获得了1个SSLVISYSTVDRLVC(AY815893)候选体被蛋白Th细胞表位。结论初步鉴定了1个潜在的体被蛋白Th细胞表位,为进一步筛选抗血吸虫保护性Th细胞表位提供了理论和实验依据。

BALB/C小鼠核小体H2B组蛋白Th细胞表位的鉴定

目的鉴定正常BALB/C小鼠核小体H2B组蛋白Th细胞表位.方法根据小鼠H2B确切氨基酸组成序列,利用计算机软件预测可能的Th细胞表位,体外固相合成,然后分别刺激BALB/C小鼠淋巴细胞,根据其中的Th细胞增生程度和白细胞介素(IL)-2分泌水平,判断实验肽是否为具有免疫活性的表位.结果共预测获得4条可能的核小体H2B组蛋白Th细胞表位,即H2B2～15、H2B14-28、H2B61～76和H2B99～113.其中H2B14-28能够明显刺激BALB/C小鼠Th淋巴细胞增生和分泌IL-2,且有明显剂量依赖关系.结论H2B14-28可能为BALB/c小鼠核小体H2B组蛋白Th细胞免疫优势表位之一.